Питательная среда для выделения и культивирования бифидобактерий

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ИЗОБРЕТЕН юл, У 43аучно-исследова молочной промьпп А, ХорькоИ, Ганина, оспелова кова, Е.хина, В.,8 аци ие рекомекой диагнчника,подисРСФСР,МЗ И, К методи 1 йзше Л У 2, с, 100 СРЕДА ДЛЯ БИФИДОБАК е относится огни, моло дицине и ка(56) Методическбактериологичесбактериоза кише1977,С 12 Н 1/20 (С 12 И 1/С 12 К 101) состава питательной среды для выделения и культивирования бифидобактерий в молочных продуктах лечебного и диетического питания, фекалияхи других субстратах. Цель изобретения - повышение качества среды засчет обеспечения стабильности ростовых свойств. Предлагается питательная среда, содержащая, масД: пелтон 0,9-1,0; лактоза 0,9-1,0; кукурузный экстракт 0,5-1,0; 1, -цистинсоляно-.кислый 001-0,02; натрий лимонно-кислый трехзамещенный 0,5-08;магний серно-кислый 7-водный 0,010,02; натрий фосфорно-кислый двухзамещенный 12-водный 0,05-0,1; калий фосфорно-кислый однозамещенный0,15-0,2; агар-агар 0,1-2,0; дистиллированная вода - остальное. Содержание живых бактерий в 1 мл через 48и 16 ч культивирования составляетдля В, Ь 11 Ыцп 1 107-10, В, ас 1 о 1 езсепхз МС 42-10-10, 2 табл, 127187210 25 ЗО 40при 37 ОС. 45 50 55 Изобретение относится к технической микробиологии, молочной промьппленности, медицине и касаетсясостава питательных сред для выделения, культивирования и количественного учета живых клеток бифидобактерий в молочных продуктах лечебного и диетического питания, фекалиях и других субстратах,Цель изобретения - повьппение качества среды за счет обеспечения стабильности ростовых свойств,Оптимизация состава питательнойсреды по ростовым свойствам и активности, введение стимуляторов ростабифидобактерий и подбор компонентовпитательной среды обеспечивает количество жизнеспособных клеток 10 -810 в 1 мл с сохранением исходных9морфологических признаков и совокупности биологических свойств,В табл, 1 приведены испытанныеварианты предлагаемой питательнойсреды,На полужидких средах с содержанием агара 0,075-0,27. при посеве 57.16-часовой культуры В,айо 1 езсепС 1 зМСнаблюдается интенсивный ростчерез 16 ч культивирования при 37 Сна средах 1 - 5, а на средах 2 и 6наблюдается задержка роста бифидо бактерий - интенсивное помутнениесреды происходит только к 24 ч. Всреде 2 снижение массовой доли кукурузного экстракта до 0,3% и цистинадо 0,057. тормозит интенсивность роста культуры. К таким же результатамприводит снижение пептона и лактозыдо 0,77 в среде 6,Повьппение массовой доли пептонаи.лактозы до 1,2% и цистина до0,03% существенного влияния на ускорение роста бифидобактерий не оказывает и находится на уровне сред3-5, Твердые среды с содержанием ага.ра 1,8-27 позволяют получать характерный рост изолированных колонийбифидобактерий при выделении чистыхкультур. При посевах чистых культур на полужидкую среду 3 и 4 с соцержанием агара 0,17 в пробирках создаются достаточные условия для роста микробов по всему объему среды с наличием поверхностной стерильной зоны, Увеличение агара до 0,27 в среде 5 позволяет получать изолированные колонии в виде гвоздиков, легко поддающиеся подсчету,Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный в количестве 0,05-017 и калий фосфорно-кислый однозамещенный вколичестве 0,15-0,27. обеспечиваютстимуляцию роста бифидобактерий. Увеличение фосфорных солей в среде 3ухудшает прозрачность среды, а уменьшение их в среде 2 ведет к снижениюростовых свойств среды, Добавлениенатрия лимонно-кислого трехзамещенного в количестве 0,5-0,87 позволяет поддерживать белки кукурузногоэкстракта в растворенном состоянии,чем достигается необходимая прозрачность среды,Проведенными испытаниями определяют оптимальные количественные соотношения компонентов среды,Сочетание экстракта кукурузы сперечисленными компонентами обеспечивает ростовую активность среды,не уступающую наиболее эффективнымпартиям известной.печеночно-цистино-вой среды, Оценку ростовых свойствсреды проводят путем посева 16-часовой культуры бифидобактерий в количестве 57 и культивирования притемпературе 37 С, Результаты учитывают через 16-48 ч по наличию интенсивного роста культуры в зависимости от видовой принадлежности, Дляпосева используют штаммы В, ЬхЕЫцш1 и В, айо 1 еэсепй 1 э МС. Контролемслужит печеночно-цистиновая средаБлаурока. Определение количествамикроорганизмов в конце культивирования в 1 мл контрольной и испытуемой среды проводят путем посевасерийных разведений на печеночно-цистиновую среды Блаурока, Результатыучитывают через 72 ч культивирования В табл. 2 приведены сравнительныехарактеристики предлагаемой средыи печоночно-цистиновой среды Блаурока,Данные, приведенные в табл. 2,свидетельствуют о том, что предлагаемая среда не уступает по ростовойэффективности известной, так как количество жизнеспособных микробныхклеток бифидобактерий, вырастающихна ней, не уступает их числу налучших партиях печеночно-цистиновойсреды, Это свидетельствует о достаточном содержании необходимых компо 127нентов и их оптимальных количествентных соотношениях в составе предлагаемой среды,Предлагаемая питательная среда отличается постоянством состава, чтообеспечивает высокую воспроизводимость результатов по ростовой активности, обладает прозрачностью, Ееприготовление не требует топоемкихподготовительных операций, Среда мо- Ожет быть быстро приготовлена в лабораторных условиях, В ней исключенанеобходимость использования животного сырья пищевого назначения (говяжья печень) и дефицитного компонента - твина, ее стоимость вдвое ниже стоимости известной среды,Предлагаемая питательная средаприготавливается следующим образом.Экстракт кукурузы разводят водопроводной водой в соотношении 1:6,фильтруют через ватно-марлевый фильтри стерилизуют при давлении 0,05 МПа(112 С) в течение 30 мин.В емкость, содержащую 700-800 мл 25дистиллированной воды, вносят 9-10 гпептона, 9-10 г лактозы, 30-60 млпредварительно разведенного в соотношении 1:6 и простерилизованногоэкстракта кукурузы, 100-200 мг солянокислого-цистина, 5-8 г лимоннокислого натрия трехзамещенного, 100200 мг магния серно-кислого 7-водного, 0,5"1,0 г натрия фосфорно-кислого двухзамещенного 12-водного,1,5-2,0 г калия фосфорно-кислого од 35нозамещенного, 1,0-2,0 г агар-агарадля жидкого варианта среды или 1820 г агар-агара для твердого варианта среды и доводят объем дистил 40лированной водой до 1 л, Смесь нагревают до расплавления агара, устанавливают рН на уровне 7,1 при помощи 407-ного раствора ИаОН или25 Е-ного раствора ИН 10 Н, разливают45в пробирки или флаконы и стерилизуют при давлении 0,05 МПа (112 С) втечение 30 мин,Полученная среда обладает высокой ростовой активностью,П р и м. е р 1, Среда для выделе 50ния бифидобактерий,Предварительно кукурузный экстрактразводят водопроводной водой в со"отношении 1:6, т,е. к 20 мл кукурузного экстракта добавляют 100 мл во 55ды, фильтруют через ватно-марлевыйфильтр и стерилизуют при давлении0,05 МПа (112 С) в течение 30 мин,1872 4В емкость, содержащую 700-800 млдистиллированной воды, вносят 1 О гпептона, 1 О г лактозы, 60 мл предварительно разведенного в соотношении1:6 и простерилиэованного кукурузного экстракта, 200 мг соляно-кислого1.-цистина, 5 г лимонно-кислого натрия трехзамещенного, 200 мл магниясерно-кислого 7-водного, 0,5 г натрия фосфорно-кислого двухзамещенного 12-водного, 1,5 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 20 г агарагара и доводят объем дистиллированной водой до 1 л. Смесь нагревают дорасплавления агара, устанавливают рНна уровне 7,1 при помощи 407-ногораствора ИаОН или 257-ного раствораИНОН, разливают в пробирки высокимстолбиком по 10 мп, после чего стерилизуют при 0,05 ИПа в течение30 мин.Перед посевом пробирки со средойнагревают в водяной бане до полногорасплавления агара и охлаждают до45 С, В каждую пробирку вносят помл взвеси испытуемого материала,предварительно разведенного физиологическим раствором до 10 , Посевыинкубируют при 37.С в течение 72 чв условиях обычного термостата дообразования типичных для бифидобактерий колоний.П р и м е р 2, Среда для количественного учета бифидобактерий вмолочных продуктах и бактериальныхпрепаратах,Питательную среду готовят указанным в примере 1 способом, с внесением агар-агара в количестве 2 г на1 л, разливают высоким столбиком впробирки и стерилизуют пс приведенному режиму.Перед посевом пробирки со средойнагревают в водяной бане до расплавления агара и охлаждают до 40 С. Вкаждую пробирку вносят по 1 мл взвеси посевного материала, предварительно разведенного физиологическим раствором до 1 О о Посевы инкубируют 48 чпри 37 СП р и м е р 3. Среда для лабораторного культивирования бифидобактерий.Предварительно кукурузный экстрактразводят водой в соотношении 1:6,т,е, к 20 мл кукурузного экстрактадобавляют 100 мл воды, фильтруют че"рез ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при 0,05 МПа в течение 30 мин.20 0,01-0,02 0,01-0,02 0,05-0,1 Остальное Т аблиц а 1 Сопержание компонентов. в среде Компоненты 7 ) г 1 Ф1 1 2. 34 0 9 0,7 11 ептон 0,7 1,2 Лактоаа Кукурузный экстракт Оу 1,2 Орб 1 0,5 Оь" 05 1.-цистин солянокислый 0,03 0,005 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02 0,01 3 127В емкость, содержащую 700-800 млдистиллированной воды, вносят 9 гпептона, 9 г лактозы, 30 мл предварительно разведенного в соотношении1:6 и простерилизованного кукурузного экстракта, 100 мг соляно-кислого1.-цистина, 8. г лимонно-кислого натрия трехзамещенного, 100 мг магниясерно-кислого 7"водного, 1,0 г натрия фосфорно-кислого двухзамещенного12-водного, 2 г калия фосфорно-кислого однозамещенного, 1 г агар"агараи доводят объем до 1 л,Смесь нагревают до расплавленияагара, устанавливают рН на уровне,2 при помощи 40%-ного раствораИаОН или 25%-ного раствора 11 Н,ОН,разливают в пробирки высоким столби.ком или во Флаконы и стерилиэуют при0,05 МПа в течение 30 мин,Перед посевом среду регенерируютча водяной бане в течение 10 мин,охлаждают до 37 С и засеивают чистой культурой рабочего штамма бифидобактерий из расчета 5% инокулятаот объема питательной среды, Посевы выдерживают при 37 ь С в течение16 ч и более (в зависимости ат видовой принадлежности) до интенсивногопомутнения питательной среды.Количество жизнеспособных микробных клеток бифидобактерий, вырастаюших на предлагаемой питательной сре"де, составляет 10-109 в 1 мл,Предлагаемая среда обладает высокой ростовой активностью, имеет более низкую стоимость и может бь 1 тьпросто и быстро приготовлена. 1872 б Формула изобретения Питательная среда для выделенияи культивированпя бифидобактерий, содержащая пептонлак. озу, Ь-цистин .соляно-кислый агар" агар, соль нат"рия и дистиллированн ую воду, о тл и ч а ю щ а я с я тем, что, сцелью повышения каче:тва среды за 10 счет обеспечения стабильности ростовых свойств, она дополнительно содержит кукурузный экстракт, магнийсерно-кислый, калий Фосфорно-кислыйоднозамещенный, а из солей натрия - 15 натрий лимонно-кислый трехзамещенный, натрий Фосфорно-кислый двухзамешенный при следуюшем соотношениикомпонентов, мас%;Пелтон 0,9-1,0Лактоза 0,9-1,0Кукурузный экстрактт 0,5-10Е-Цистин солянокислый25 Натрий лимоннокислый трехзамещенный О, 5-0,8Магний серноки слыйЗО Натрий Фосфорнокислый двухзамещенныйКалий фосфорнокислый однозамещенный 15-0Агар-агар 0,1-2,0Дистиллированная вода1271872 Продолжение табл.1 Содержание компонентов в среде Компоненты 1 2 Э 4 5 6 7 8 0 б 05 07 0 б 08 0 б 0,3 Магний сернокислый 7-водный 001 0,0 0,01 00 0,02 0,0 0,01 0,02 0,05 О, О,5 О, О,0,05 02 0,0 0,3 0,2 О,5 0,25 0,2 0,2О, 0,2 0,2 1,8 2 О,О,0,075 0,075 О Агар Вода дистил- лированная Осталь- Осталь- Осталь" Осталь- Осталь"иое ное ное ное ное Осталь- Остальное ное Т аблиц а 2 Питательная среда Время культивирования, ч одержание живыхактерий вмл ВЪГ 1 В. айо 1сепсисаМСедлагаемая Оо 0 -О Выборочные наиболее активные партии печеночноцистиновой сре 0 -108 1 О оставитель И. Приехред А,Кравчук лова Корректор М СамбоРска Яцола едактор тираж 490 ВНИИПИ Государственног па делам изобретений 3035, Москва, Ж, РаушЗаказ 6310 25 Подписноекомитета СССРи открытийская наб., д. 4/5 роиз Ужгород, у оектная, 4 д ственно-полиграфическое предприятие,Натрий лимоннокислый трехэамеще нный Натрий фосфорнокислый двухэаиещенный 2-водный Калий фосфоРно- кислый одноэа- иещениый Ъ 1 Г 1 В. ас 1 ош 1 1 еасепс 1 МС