Способ получения пепстатинов

Союз Советскии Социалистицескии Респубттик(3 Государственный иомитет Совета Министров СССР но делам изооретвний н открытий(45) Дата оп вания описания 1501Ми ян каак КохтароАеаги айси м уй Кай у Кагак явител(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПСТАТИН а Иностранная ф Зейдан Ходзи БисейбиИзобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения лекарственного препарата,который может быть использован при лечении язвы желудка. Известен способ получения пепстатинов, заключающийся в том, что штаммы бает ер 1 отзсео Севтасеня АТСС 921469 или -Иперсоезсео адгеп 1- со 1 оо ат,1 оюопосемЙ АТСС 921468 выращивают в аэробных условиях на пнтатель ной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли,с .последую. щим выделением целевого продукта экстракцией к -бутанолом культуральной жидкости и дальнейшей очисткой 111, 15Однако известный способ не обеспечивает получения пепстатинов В и С.Длит получения пепстатинов В и С по предлагаемому способу в качестве источников азота используют казеин, сня-,щ тое молоко и/или соевую муку, целевой продукт экстрагируют и этерифицируют низшим спиртом и отделяют.в виде низшего алкилового эфира.Пепстатины: получают посредством 25 выращивания непстатинобразующих штам- мов Ьттертотп сев 1 ев 1 а сено АТСС Р 21469 или баетер 1 отпъ сев аот ен 1 эоСцв чат.сооносене 1 э АТСС те 21468 на питательной среде, содержащей казеин, ЗО снятое молоко и/или соевую муку в качестве источника азота и инкубируют3-10 дней в обычных аэробных условияхдо достижения культурой максимальнойантипепсинной активности. Активноевещество экстрагируют и. -бутаноломиз культуральноф жидкости или ее Фильтрата или метанолом из мицелиальноймассы. Полученйый экстракт концентрируют до сиропа или желтого осадка. 3тем сироп вливают по каплям в 5-20объемов воды для получения осадка иосадок отфильтровывают. Осадок высушивают и получают неочийенные новыепепстатины. Неочищенный пепстатин растворяют в низших спиртах и этерифицируют путем нагревания или выдержки втечение нескольких часов при комнатнойили повышенной температуре с небольшим количествоМ катализатора этерификации, например с соляной или сернойкислотой, тт -толуолсульфокислотой,хлористым тионилом, пятихлористым фосфором йли хлорокисью фосфора.Получаемый при этерификации метиловый эфирнеочищенного пепстатина является смесью и большую часть метилового эфирапепстатина выкрщ;таллизовывают ир метанола. С пома 4 ью тонкослойной хроматографии ытто найдено, что метиловыеэфиры пепстатина и новые пепстатинысоДержатся в отноШении 1:1. Пепстатины В и С перекристаллизовывают изметанола и выпавшие кристаллы отфильтровывают. Маточный раствор почти не 5содержит метилового эфира пепстатинаи новые пепстатины выкристаллизовывают из этого маточного раствора в видетонких игл,Щелочные соли новых пепстатинов, Онапример полученный в виде натриевойсоли пепстатин В, представляетсобой белый аморфный порошок, которыйп 7 жвится с разложением при 250-255 С,обнаруживает ингибированиепепсина 15.Э ц ) при 0,05 1 . Он в 10 раз луч-.ше 00 мг/мл) растворяется в метаноле, чем исходный. Он растворим в водном бутаноле, этанолеизопропиловомспирте, диметилформамнде, диметилсуль 20фоксиде, уксусной кислоте, пиридине,слегка растворим в водном ацетоне,трудно растворим в безводном ацетонебезводном бутаноле, хлороформе, бензоею эфире и водеП р и м е р 1. Штаммом Ыгвр 1 отсез 1 еьосею,образующим пепстатин заражают стерильную среду, состава,вес.Глюкоза 5,5 30Соевое масло 2Снятое молоко 4,5Казеин 5Х Ндо 0,15йоС 3 0,35 35Мба+ 7 И 0 0 с 15(рн6,45)в 2900 л объема и инкубируют 112 чпри 23-24 С при аэрации и перемешивании. Культуральная жидкость содержитантипепсинное вещество, эквивалентное 402260 Д мл пепстатина, При помощи разбавленной серной кислоты рН жидкостидоводят до 2,5 и добавляют 3600 лметанола. Затем жидкость геремешивают40 мин при температуре 15-20 С, добавляют 4 вспомогательного порошкадля Фильтрования, отфильтровывают и.промывают. При помощи щелочи рН доводят до 10, метанол испаряют в вакуумеи получают 1900 л водного достатка,К этому остатку добавляют 800 л н -бутанола и рН смеси доводят до 7,0,После перемешивания в течение 30 минпри 20 С отделяют 960 л" бутанольногоэкстракта. Затем рЯ бутанольного экстракта доводят до 3,0 и концентрированием в вакууме получают 55 л концентрированного сиропаЭтот сироппо каплям и при перемешивании добавляют в течение 60 мин в 800 л воды иобразующийся осадок отфильтровывают. 60Осадок промывают водой,лйофилизируюти получают 7990 г желтого, неочищенного порошка новых пепстатинов. Антипепсинное вещество, эквивалентное пепстатину, составляло 64 порошка, бб 6080 г полученного неочищенного порошка растворяют в 33 л метанола и для обесцвечивания добавляют 1,25 кг активированного угля. К 38 л этого обесцвеченного метанольного раствора добавляют 125 мл концентрированной серной кислоты и перемешивают 2,5 чопри 60 С. Реакционную смесь нейтрализуют добавлением 0,63 л триэтиламина, перемешивают 120 мин при 50-60 С и получают кристаллический порошок. После промывки и сушки этого порошка в вакууме получают 3230 г метиловых эфиров нового пепстатина, имеющего антипепсинную активность ( ( 1) ) при 0,056 3 . Он плавится с разложением при 250-251 С, ЩР =90 (С 1,0, уксусная кислота) . Этот порошок содержит более 80 метилового эфира пепстатина В ( К 0,39 по данным хроматографии в тонком слое).П р и м е р 2. 3100 г нового метилового эфира пепстатина, полученного в примере 1, растворяют в 130 л 2 н, НаОН 90 метанола при 60 С и омыляют 2 ч, Реакционную смесь концентрируют в вакууме для испарения метанола и получают грязевидный концентрат. Концентрат растворяют в 20 мл воды, насыщенной н -бутанолом, добавляют 15 л воды и с помощью разбавленной Фурфуриловой кислоты рН доводят до 3,0. После 20-минутного перемешивания, 18 л верхнего бутанольного слоя по каплям выливают в 270 л воды. Образовавшийся осадок после 60-минутНого перемешивания отфильтровывают и промывают водой. Промытый осадок высушивают в вакууме и получают 2500 г ,белого порошка. Этот порошок плв 0 ится с разложением при 205-210 фС и А -84Э (С м 1,0 - метанол), ЬР(50) ингибитирование по отношенйю к пепсину было 0,055. Согласно кривой титрования на 700 мг порошка расходовалось 9,7 мл 0,1 н. МсОНП р и м е р 3. 100 г метиловых эфиров нового пепстатина, полученного в примере 1, растворяют в 4 л абсолютного метанола и обесцвечивают 20 г активированного угля, Метанольный раствор оставляют стоятьна ночь и получают сперва 24 г белых кристаллов.4,2 л метанольного маточного раствора концентрируют до 1,3 л и осаждают. Этот осадок кристаллизуют после 60 мин перемешивавия при 60 С. Повторная кристаллизация через 12 ч дает еще 5,5 г вторичных белых кристаллов. Эти кристаллы растворяют в 1,5 г горячего ме" танола и обрабатывают активированным углем. Метанольный раствор оставляют стсять на ночь и получают еще 12,0 г белых кристаллов.Указанные кристаллы имеют следующиефизико-химические свойства.40 Кристаллы после первой кристаллизации:т. пл. 250-251 С (разложение),д.1 =-90,5 С (С 0,5, уксусная кислога), ).2 = О,ОЩВещество йО, 35: Вещество Я О, 391:1-1:2 (хроматография в тонком слоехлороформ:метанол:уксусная кислота"94:4:1),Кристаллы после второй кристаллиэации:т,пл, 253-254 С (разложение ),Г20о .) = -91,5( (С0,5, уксусная кислота), (Э = 0,05.Эти крйсталлы главным образом со- (5держат вещество с й 0,35 и следывещества с М 0,42 (хроматография втонком слое, хлороформ:метанол."уксусная кислота = 95:4:1),20Кристаллы после третьей кристаллизации: т.пл 254-255 С (разложение),Ыв-95,5 С (С = 0,5 уксусная кислота) (.Э =0,05 е .Эти кристаллы содержат главным образом вещество М 0,39 (пепстатинВ) и следы вещества, имеющего К 0,42.(хроматография в тонком слое, хлороформ:метанол:уксусная кислота =95:4;1).Найдено, Ъ: С 60,14; Н 9,38; 9,74.Полученные вещества умеренно раст 30воримы в диметилсульфоксиде,диметилформамиде и уксусной кислоте, труднорастворимы в метаноле (5-10 мг/мл),но более растворимы, чем метиловыйэфир пепстатина.35 П р и м е р . 4. Штаммом, образующим пепстатин,. заражают 130 л стерильной среды состава, вес.В:1 люкоэа 6,0Глицерин 2,0Снятое молоко 4Молочный каэеин 4,5К,НРО 4 0,1и се 0,3 45МЯ 504 7 НО 0,1 (рН 6,8)и инкубируют как в примере 1. К 125 л культуральной жидкости, оодержащей антипепсинное вещество в количестве, эквивалентном 170 гпепстатина 50 добавляют 60 л и -бутанола и перемешивают 40 мин при комнатной температуре. После этого бутаиольный, вод" ный и твердый слои (мицеляльная масса) разделаот центрифугированием. Бутанольный слой промывают водой и концентрируют в вакууме до.1,5 л сиропа. рН сиропа доводят до 3,0, до- бавляют 7,5 л н -гексана и при перемешивании получают желтовато-коричневый осадок. После 60-минутного пе 60 ремешивания осадок:отфкльтровывают, провивают и высушивают в вакууме и получают 164,г нового неочищенного пепстатииа, имеющего антипепсиннуюактивность 11 о= 0075 3"65 150 г нового пепстагина растворяют в 1,5 л 90-ного метанола при 40 С и обесцвечивают 150 г активированного угля.К 1,6 г обесцвеченного метаноль" ного раствора добавляют 1,0 л воды при комнатной температуре и получают студенистый осадок. Осадок отфильтровывают, промывают 50-ным метанолом, лиофилиэируют и получают 94 г слегка желтоватого порошкаЕго ) Э по отношению к пепсину 0,062 7 Этот порошок растворяют в 90-ном метаноле, дважды обрабатывают активированным углем и получают 15 г порошка нового пепстатина. Его И 0,055 е 7, точка разложения 198-205 С и 1 А)В = -79 С (С1,0 метанол). При хроматографии в тонком .слое он имеет Я0,35 (пепстатин)0,39 (пепстатин В и пепстатин С) и К 0,42.П р и м е р 5, Штаммом, образующим пепстатин, заражают 130 л стерильной среды состава, вес.Ъ:Глюкоза 6,0Глицерин 2,0Снятое молоко 1,5Казеин 1,5Соевая мука 5,7К,НР 04 О, 1ма се 0,3и Мд 50, 7 Н 0 0,1 (рН 5,5) и инкубируют,. как в примере 1.110 л культуральной жидкости, содержащей антипепсинное вещество в количестве, эквивалентном 132 г пепстатина, отфильтровывают с добавлением 7 кг вспомогательного средства для Фильтрования; с помощью разбавленной серной кислоты рН доводят до 2,0 и отделяют 33 кг мицеляльного остатка и 75 л фильтрата. К Мицеляльному остатку добавляют 82 л абсолютного метанола и получают взвесь, которую переме- шивают 40 мин..После этого взвесь отфильтровывают и остаток дважды прогрызают 40 л 70- ного метанола и.получают 140 л водного метанольного элюата. К этому Фильтрату добавлаот 35 л Н -бутанола и после 15-минутного перемешивания отделяют 37 л бутанольного слоя от 73 л водного слоя. 140 л вышеуказанного водного метанольного элюата, полученного .из мицеляльного осадка концен" ,трируют в вакууме до 37 л водного раствора и смешивают с 37 л бутанольного экстракта, полученного из фильтрата культуральной жидкости. Эту смесь центрифугируют для удаления водного слоя и получают 35 л бутанольного экстракта, После доведения рН бутанольного экстракта до 3,0 его концентрируют в вакууме до 1 л сиропа. Этот сироп по каплям добавляют в 15 л вды, перемешивают и получают осадок. Осадок отфильтровываютпромывают водой,высушивают при 60-70 С и получают 153 г желтоватого порошка нового непстатина, имеющего антипепсинную активность).П50 0,072 , Полученный порошок этеоифицируют метанолом, как описано н примере 1, и получают 62 г белого кристаллического порошка метилового эфира нового непстатина, Его (1) = 0,05, у точка разложения 250-352 С и (.йЛ -90,6 (С " 0,5, уксусная кислота). С помо щью хроматографии в тонком слое устанавливают, что он содержит главным образом метиловый эфир нового пенстатина ( к 1 0,39) и следы метилового эФира пепстатина. 1530 г полученного метилового эфира нового пепстатина омыляют н 450 мл раствора 0,2 н. ЙаОН н 90-ном метаноле в течение 2 ч при 60 С. С помощью разбавленной нИ рИ реакционной 20 смеси доводят до 3,5 и смесь концентрируют до 150 мп с образованием осадка, Осадок отфильтронынают,промывают метанолом, высушивают н вакууме и получают белый порошок (17,9 г) натрие,вой соли нового пепстатина, .имеющий Л, 0,05 7 , т,пл. 245-249 С (разложение) и Гд 3= - 34 (С = 1,0 метанол) . При его титронании на 700 мг расходуется 10,1 мл 0,1 Н,БОс.П р и м е р б. Штаммом, образующим пепстатин, заражают 130 л стерильной среды состава, нес.Ъ;Глюкоза 6,0Глицерин 2,0Молочный казеин 4,2Пептон 1,0К 2 нр 04 0,1ИаСЯ 0,30М 604 7 Н 20 (рН 7,0) 1и йнкубирование проводят 132, 5 ч40 н условиях, указанных н примере 1.130 л культуральной жидкости, содержащей антипепсинное вещество и количестве, эквивалентном 111 г пепстатина, обрабатывают так же, как н примере 1, и получают 132 г неочищенного нового пепстатина имеющего сй - по оношению к пепсину " 0,076.Полученный таким образом желтый порошок обрабатывают, как е 7 писано в примере 1, и получают 53,5 г метилового эфира нового пеНстатина., имеющего ЬЗ " 0,05 1 у, точку разложения 255-256 С и 1 с 1.2 = -95,5 О (С " 0,5 ф уксусная кислота). С помощью хромато графин и тонком слое определяют.й 0,35 и Я 0,39 (1:1), но к , 0,42отсутствует, Полученный таким образом пепстатиноный препарат содержитравное количество нового пепстатина 60(1:1). П р и м е р 7. Новый пепстатин нсвободной кислотной форме (4 г), по-,лученный в примере 2, растворяют н100 мл абсолютного этанола при нагре нанни и добавляют 2 мл концентрированной Н 504 Эту смесь нагревают собратным холодильником на кипящей водяной бане б ч и концентрируют в вакууме до 50 мл. Образовавшийся осадокотфильтровывают, проьынают этанолом,высушивают и получают 16 г порошка.Порошок перекристаллизонывают из абсолютного этанола (100 мл) и получают1,15 г белого кристаллического порошка этилового эфира нового пепстатина)В 5 = 0,052 Т, точку разложения 250251 С и 1 с(.) = -90 (С = 0,5, уксуснаякислота),П р и м е р 8. 3,0 г нового пепстатина, полученного в примере 2, растворяют в 100 мл абсолютного и -пропилового спирта при нагревании, добавляют 0,2 мл концентрированной сернойкислоты и этерифицируют 6 ч при 80 С.Реакционную смесь концентрируют ввакууме до 20 мп с образование осадка,Осадок отфильтровывают, промываютЦ -пропиловым спиртом, высушинают иполучают 900 мг белого порошка. Этотпорошок перекристаллизовынают из 40 млабсолютного пропилового спирта и получают 480 мг белого порошка ( я -пропилоный эфир пепстатина В). Он имеетИ = 0073 3 т.пл. 218-220 С (разложение) и д 1 = -89, 5 (С = О, 5, уксусная кислота),П р и м е р 9. 3,0 г пепстатина,полученного в примере 1, растворяют в 100 мп теплого абсолютного н -бутанола и добанляют 0,2 мл концентри- рованной серной кислоты. Этерификация продолжается б ч при 80 С, раствор концентрируют н вакууме до 2 мл с образонанием осадка. Осадок отфильтровывают, проклинают ,Н -бутанолом, высушивают и получают 800 мг белого порошка. Порошок перекристаллизовывают из н -бутанола и получают 340 мг белого порошка ( н -бутиловый эфир нового пенстатина В), имеющего ( З 5,=0,084 1, т.пл. 205-207 С (разложение) и ГАЗ,= -88 (С0,5, уксусная кислота) .Формула изобретенияСпособ получения пепстатинов путем, выращивания штамма .Ы 1 ер 1 опсев 1 ез 1 асепь,ОТСС 921469 или Ыгер 1 отчсез адгепЬВ 81 ое маг. Тозопосеое 1 е ОТСС 921468 на питательной среде, содержа" щей источники азота, углерода и ьянеральные соли с последующим выделением целевого продукта,а т Л и ч а ю- щ и й с я тем, что, с целью получе=ф ния пепстатинон В и С, н качестве источников азота используют казеин, сня588927 Составитель С.МалютинаР акто Л.Емельянова Техред А,Богдан Корректор С,Ямалова Заказ 195/721 Тира:к 568Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Иинистров СССР по делам иэобретений и открытий 113035 Иосква 3-35 Ра ская наб. , 4 5филиал ППП Патент, г. Умгород, Ул, Проектная, 4 тое молоко и/или соевую муку, целевойпродукт экстрагируют и этерифицируютнизшим спиртом и отделяют в виде низшего алкилового эфира. Источники информации, принятые вовнимание при экспертиэег1. Хоцгоай АоФдЬо 1 э,923, 5,р.259, 263.