Штамм trichoderma vir1de ген-к9-10-продуцент целлюлолитических ферментов1

О П И С А Н И Е 399522ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик Зависимое от авт. свидетельстваЗаявлено ЗО,Х 11,1971 ( 173115528-13) С 120 1(3/1 с присоединением заявкисудерстеенни(и камитетсвета Министрав СССРее делам изесретенийи ОтиРьзтиЙ иоритетубликовано 973. Бюллетень39 УДК 577,15.07(088,8 ата опубликования описацня 28.П.1974 Авторыизобретенвител АММ ТК 1 СНООЕВМА 1 г 1 КОЕ ГЕН-К 9-10-ПРОДУЦЕН ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВобласти микрок штамму Тг(сйодуценту целлюлое 40 - 50(х опил 30 - 40аге 80 - 90 1,50,18 Изобретение относится кбиологии, а более точно -сегта огде Ген-К 9-10-пролитических ферментов.Целлюлолитические ферменты осуществляют энзиматический гидролиз целлюлозосодержащих растительных субстратов. Конечным продуктом гидролиза является глюкоза.Препараты целлюлолитических ферментов, получаемые путем микробиологического синтеза, используются для переработки отходов сельского хозяйства, в пищевой промышленности, в фармакологии, и (наиболее широко - в животноводстве для улучшения качеств грубых растительных кормов и трудцосилосуемых трав.Предлагается штамм культуры Тг(сапогегта игИе Ген-К 9-10-мутант, полученный в результате применения мутагенного фактора У-метил-Л(-нитро-Л(-нитрозогуанидина с последующим ступенчатым отбором активного варианта.Новый штамм выведен из штамма1 культуры Тг(стойегта тгЫе.Штамм Ген-К 9-10 (в лабораторных условиях) ца седьмые сутки роста ца жидкой питательной среде со свекловичным жомом в качестве источника углерода имеет следующее среднее превышение в активности ферментов ца разных субстратах, %: На обезжиренном хлопкНа смешанных древеснькахНа фильтровальной бум1-1 а натрий-карбоксиметилцеллюлозе (определецие поглюкозе) 25 - 351-1 а натрий-карбоксиметилцеллюлозе (определение поизменению вязкости раствора) 50 - 55При проведении фермецтациц на той же среде в фермецтерах опытной установки, на шестыс-седьмые сутки роста штамм Ген-К 9-10 имеет следу(ощее превышение в активности ферментов ца разных субстрактах по сравнению со штаммом1, %:На обезжиренном хлопке 30 - 40 На цатрий-карбоксиметилцеллюлозе (определениепо изменению вязкости раствора) 35 - 40Содержание растворимого белка в фильт рах культур, выращенных в лабораторных условиях в течение семи суток ца жидкой питатсльпой среде со свекловичным жомом в качестве источника углерода, составляет, лс%(.(:Штамм Гец-К 9-10 4 Штамм1399522 Характеристика культурно-морфологических признаков штамма Тг 1 сЬобегша ч 1 гЫ с Ген-К 9-1 О в сравнении с исходным штаммом Тг 1 сйодеггпа 1 гЫс1Таблица 1 Гец-К 9-10 Среды Синтетическая среда ЧапекаРост 7 сутокТ 28 СПосев уколом СинтетическаяРост 12 сутокТ 28 СПосев уколом среда с крахмалом Сусло-агарРост 4 сутокТ 28 СПосев уколом среда по прописи с добавлением 1 о экстракта Ломтики картофеляРост 30 сутокТ 28 СПосев штрихом Разжижения це наблюдается вплоть до 30 суток инкубации Послойное разжижение наблюдается к 6 - 7-му дню инкубации,ЖелатинаРост 30 сутокТ 28 СПосев уколом Молоко пеитоиизирует медленнорН среды 7,7 - 7,8 Молоко (не агаризованное, рН 6,3)Рост 30 сутокТ 28 СПосев суспензией спор Молоко пептонизирует быстрорН среды не меняется Слабое восстановление наблюдается к 30-ым суткам инкубации Восстановление наблюдается к 10-му дню инкубацип НитратыРост 30 сутокТ 28 СПосев суспензией спор Крахмал гидролизует интенсивно,Крахмал гидролизуст слабо. КрахмалРост 10 сутокТ 28 СПосев суспензией спор П р и и е ч а н и е. На жидких средах с различными источниками углерода, (глюкозойгалактозой, лактозой,мальтозой, ксилозой, маннозой, рамнозой, сахарозой и глицерином) существенных различий в характере роста иенаблюдается. ОрганическаяРоулен-Тома кукурузного Рост 4 суток Т 28 С Посев уколом 1. Колония занимает всю поверхность чашки.2. Воздушный мицелий тонкий, стелющийся, бесцветный3, Конидий в желтых подушечках, расположенных компактно в центре колонии и редко по периферии,4. Среда не окрашена,1. Диаметр колонии 65 .и,и.2. Воздушный мицслий ползучий,едва заметный, бесцветный,3. Конидий не образуется.4. Среда не окрашена,1, Колония занимает всю поверхность чашки,2. Воздушный мицелий белый, войлочный, хорошо развит по всейповерхности колонии.3 Конидии в желтых или беловатых подушечках, расположенныхпо всей поверхности колонии,4. Среда окрашена в светло-желтый цвет. 1, Колония занимает всю поверхность чашки.2. Воздушный мицелий бесцветный, тонкий, распростертый.3. Конидии в беловато-зеленых подушечках, расположены в центре колонии и редко по периферии.4. Среда не окрашена,1. Рост ограничен только поштриху,2. Воздушный мицглий развит хорошо, бесцветный,3. Конидии в зеленых подушечках4. Субстрат не окрашен. 1. Диаметр колонии 90 и.я.2. Воздушцьй мпцелий тонк й, слегка ириподнимающицся, бесцветный,3. Коцидии в виде зеленых подушечек, расположенных в центре.4, Среда окрашена в яркий зеленовато-желтый цвет. 1, Диаметр колонии 34 льи.2. Воздушный ми цезий иаутицообразный, приподнимающийся, бес 3. Кон; дии в виде редких зеленыхподушечек в месте укола.4. Среда не о к ра шеи а. 1. Диаметр колонии 70 лси.2. Воздушный мицелий бесцветный,прижатый, с хорошо выраженными концентрическими окружностями.3. Конидий не образуется,4. Среда окрашсна в желтый цвет. 1, Колония занимает почти всю поверхность чашки.2. Воздушньш мице;ий бесцветный,тонкий. Хорошо выражена радиальная исчерчецность,3. Конидий не ооразуется,4. Среда не окрашена,1, Рост очень интенсивный, захватывает всю поверхность ломтика,2. Воздушный мицелий пушистый,желтый.3, Конидиеобразовацие обильное.4. Субстрат интенсивно окрашен вярко-желтый цвет,399522 Характеристика цитологических особенностей штамма Тггс 1 гобегша вгЫе Ген-К 9-10 в сравнении с исходным штаммом Тг 1 сЬобегша ч 1 гЫе1 на синтетической среде Чапека;или (1 х 1 Н 4) б 4 НОгМотОд20 рН 40 42 0,510,0 10,0 1,0 0,8 0,5 Сравнение уровней биосинтеза целлюлолнтических ферментов штаммом Тпс 1 годегтпа игЫе Ген-К 9-1 О и штаммом ТггсЬобегпга м 1 ггйе1Таблица 2 Активность Количество повторных проверокштаммы Суостраты отношение Ген-К 9-10 к 1 Измерение активности 1 Ген К 9 10 В лабораторных условиях Обезжиренный хлопок Смешанные древесные опилки фильтровальная бумага Натрий-карбоксиметплцеллюлозаНатрий-карбоксиметилцеллюлозаРастворимый белок Глюкоза лгг/я,г Глюкоза ягял Глюкоза, лгг ял Глюкоза, лгг,лгл 11,44 12,92 1,54 17,08 7,97 9,64 0,83 13,23 1,44 1,34 1,86 1,29 Изменение вязкости раствораОпределение по методуЛоури, яг/юг 31,41 1,53 20,60 8,56 1,54 0,18 рН культуральной жидкости на 7-е сутки роста 5,9 - 6,1 3,4 - 3,6 В условиях опытной остановки Обезжпренньш хлопокНатрий-карбоксиметилцеллюлоза Глюкоза, яг/лглИзменение вязкости раст- вора 11,84 20,25 8,7014,72 1,36 1,38 1, Набухание конидий через 8 - 10 час инкубацип,2. Прорастание конидпй через 16 час инкуоацип, какправило, с одного конца, редко с двух,3. Гифы длинные, волокнистые, слегка разветвленные,окрашены интенсивно.4. Конидпеносцы формируются к 49 час инкубапии,ветвистые,5. Зрелые коиидпи появляются через 96 час инкубацпи, Конпдиеобразование сильное. 6, Конпдип крупные, овальнь;е, окрашены в синий цвет с ярким красным ядром,7. Лпзис культуры наблюдается через 144 час инкубацип,Штамм Ген-К 9-10 хранят в виде лиофильно высушеных конидий культуры в стеклянных ампулах.Питательные среды для выращивания посевного материала и ферментапии штамма Тггсlгойегтп пггЫе Ген-К 9-10.Среда для выращивания посевн о г о м а т е р и а л а. Лгаризованная среда по прописи Роулен-Тома с добавлением 1% кукурузного экстракта.Среда для фермептации, %;Свекловичный жом 4,0(МН 4) 804 0,14 КНгР 04 0,1М 50., 0,03 СаС 1. 0,03 Мочевина 0,3 Микроэлементы, лгг/л среды;1.е 80 НяОХпС 1 яМп 504 1-1.0 1, Набухание конидий через 4 - 6 час инкубации.2, Прорастание конидий через 8 - 10 час инкубации,как правило, с двух концов, иногда с трех.53, Гпфы длинные и короткие, сильно искривленные,ветвистые, окрашены интенсивно.4. Конпдиеносцы формируются к 24 час инкубации,сильно ветвистые. 5. Зрелые конидии появляются к 30 час инкубации. Конпдиеобразование менее обильное, чем у штамма6. Конидпп меньшего размера, чем у штамма1.форма и окраска те же.7, Лизис культуры наблюдается через 72 час инку 15 бацпи,Выращивание посевного материала и условия ферментации.Культуру штамма ТггеЕойегта игЫе ГенК 9-10 выращивают четверо суток при 28 С наскошенном агаре (по прописи Роулен-Тома сдобавлением 1% кукурузного экстракта). Посевным материалом служит водная суспензияконидий культуры, выращенной на агаризо 30 ванной среде. Количество инокулята 5 - 10%от объема засеваемой среды,Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера емкостью 250 лг,г. Объем среды 50 мл,Инкубапия 7 суток при 28 С на качалках,35 вращающихся со скоростью 220 - 250 оборотов в лгин.399522 Таблица 3 Использованные методы количественного определения содержания целлюлоз в фильтратах культуральной и идкостиСостав реакционных смесей времятемпера тура, С Калориметрическпй метод определения количества мг редукцирующпх сахаров по методу Сомоджп-Нельсона в модификации Родионовой 25 мг0,5 лгл 9 б час Кол чество глюкозы, мг, образующейся прп, действии на субстрат 1 лсл неразведенного фпльтрата культу- ральной жидкости 50 2,5 мл50 лг10 лгл 24 час1,0 лгл 10 лг 50 2,0 мл 1 час0,5 мл 2,5 мл 1 час 0,5 мл Впскозометрический метод определения изменения вязкости раствора натрий-кар- боксиметилцеллюлозы Изменение обратной величины относительной вязкости раствора за 1 лшн при действии 1 мл неразведенного фильтрата культуральной жидкости 5,0 мл 0,5 мл О, 2, 4,б ман50 0,5 мл Предмет из о бр етения В условиях опытной установки ферчентацию осуществляют в ферментсра.с емкостью 20 л. Объем среды 10 л, В качестве пеногасителя,используот кашалотовый жир 1. Обезжиренный хлопокАцетатный буфер 0,1 моль,рН 5,0Фильтрат культуральнойжидкости в соответствующем разведении2. Смешанные древесныеопилкиНатрий-цитратный буфер0,05 лголь, рН 4,8Фильтрат культуральнойжидкости в соответствующем разведении3, Размельченная фильтровальная бумага фпльтрат3)Ацетатный буфер 0,1 моль,РН 4,7Фильтрат культуральнойЖидкости в соответствующем разведении4. Раствор натрий-карбокспметилцеллюлозы (степеньполимеризации 350, степень замещения 55), приготовленный на ацетатномбуфере 0,05 моль, рН 4,5,Концентрация 0,3),Фнльтрат культуральнойжидкости в соответствуЮщим разведении5. Раствор натрий-карбоксиметилцеллюлозы (данныете же, что в и. 4), приготовленный на дистиллированной водеАцетатный буфер 1 моль,рН 5,6Фильтрат культуральнойжидкости в соответствующем разведении 1 Птамм ТпсЬойегта игЫе Геп-К 9-10-продуцент целлюлолитическпх фсрчептов. Куль. турально-морфологические признаки,Синтетическая среда Чапека. Посев уколом. Через 7 суток роста при 28 С диаметр колоний 90 млг. Воздушный мицелий тошсий, слегка приподнятый, бесцветный. Конидий в виде зеленых подушечек, расположенных в центре. Среда окрашивается -; яркий зеленовато-желтый цвет,Синтетическая среда с крахмалом. Посев уколом. Черсз 12 суток роста прп 28 С диаметр колонии 34 ллг, В месте укола образу(0,4 об. %). Объем подаваемого воздуха 1; 1 в гнпи. Псремсшивание со скоростью 700 оборотов в лгпьи Продолжительность ферментанин 7 суток. Температура инкубапии 28 С. ются конидий в виде редких зеленых подушечск. Среда нс окрашивается.Сусло-агар. Черсз четверо суток роста при28 С диаметр колоний 70 млг, Воздушный минслий бесцветный, прижатый, с хорошо вы)ажсннычн 1 соппснт 1)ическими окружностями.10 1(онндии нс образуются. Среда окрашивается в желтый цвет.Органическая среда Роулен-Тома с добавлением. 1 й кукурузного экстракта. Конидий лс образует. Среда пс изменяет цвета.15 Ломтики картофеля. Посев штрихом. Через 30 суток выращивания при 28 С колония зар:,1 ва.т всю поверхность ломтика, Воздушнь", минслий пушистый, желтый. Конидиеоб399522 10 Корректор Е, Миронова Техред Т, Ускова Редактор О. Стенина Заказ 800/7 Изд, Хе 70 Тираж 467 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 разование обильное. Субстрат интенсивно окрашен в ярко-желтый цвет,Желатину не разжижает (через 30 суток инкубирования).Молоко пептонизирует медленно. рН среды 7,7 - 7,8.Нитраты восстанавливают к 30 суткам инкубации.Крахмал гидролизует интенсивно, Отношение к источникам углерода. Глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу, ксилозу, маннозу, рамнозу, сахарозу, глицерин ассимилирует. 5 Цитологические особенности штамма насинтетической среде Чапека. Набухание конидий происходит через 4 - 6 час инкубации, прорастание через 8 - 10 час инкубации, чаще с двух концов, иногда - с трех.10 Гифы длинные и короткие, сильно искривленные, ветвистые, интенсивно окрашенные.Конидиеносцы формируются к 24 час инкубации, ветвистые.Зрелые конидии образуются к 30 час ин кубации.Лизис культуры через 72 час инкубации.