Способ диагностики вторичного иммунодефицита при хронической нв-вирусной инфекции у детей

(57) Использ логия вирусн ричного имм детей, страд стирующим в - упрощение ния: в сывор вень а -ти менее 831 и диагностиру цит. етение относ нической имму и предназначеиммунодефи традающих хр м вирусным геп гормона тиму их крови,е Изобр точне кли инфекций вторичногоу детей, с стирующи держанию сыворотке Среди роль в фо форь и хр вируСномуится к медицине, нологии вирусных но для выявления ЦИТНОГО СОСТОЯНИЯ оническим персиатитом "В" по соа а -тимозина в вирусных грмированиионизации про гепатиту В (В патитов ведущая наиболее тяжелых есса принадлежит В"). ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(71) Ленинградский научно-исследовательски) институт детских инфекций(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВТОРИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ НВ-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ УДЕТЕЙ При ВГ "В" в патогенезе инфекции важная роль принадлежит особенностям иммуннго ответа заболевшего, приводящим к развитию вторичного иммунодефицитного состояния и развитию иммунного цитолиза в печни.В последние годы многочисленные исследования советских и зарубежных авторов подтверждают факт инициирования НВ-вирусоь иммунокомпетентных клеток (ИКК), Взаимодействуя с мембраной ИКК НВ-вирус нарушает их нормальное функционирование, следствием чего является стойкая ование:. клиническая иммуноых инфекций, выявление втоунодефиЦитного состояния у ающих хроническими персиирусным гепатитом "В". Цель способа, Сущность изобретеотке крови определяют уромозина и при его значениях г/мл или более 1475 пг/мл ют вторичный иммунодефииммуносупрессия и формирование хронического процесса.Характер иммунодефицита при ВГ "В" по существу и определяет клинические особенности болезни и исход заболевания в целом,Степень выраженности иммуносупрессии может определяться не только непосредственным инфицированием ИКК, но и нарушением сложных механизмов иммуно-. регуляции.В этой системе важная роль принадлежит функциональному состоянию тимуса и его гормонам, регулирующим дифференцировку ИКК и обеспечивающим их эффекторные функции, Нарушение гуморальной активности тимуса неизбежно приводит к дисбалансу Т клеточных популяций и сопровождается той или иной степенью выраженности иммунодефицита,В экспериментах на иммунодефицитных животных и в клинической практике (у больных первичными иммунодефицитными состояниями, ревматоидным артритом, первичным билиарным циррозом печени, красной волчанкой, ХАГ "В", карциномой легких, 1802329бронхиальной астмой) лечение препаратами тимусных гормонов приводило к нарастанию числа ауто- и Е-РОК, увеличению выработки иммуноглобулинов, усилению реакции Т-лимфоцитов на митогены.Среди большой группы известных в настоящее время тимусных факторов большой интерес исследователей и практических врачей привлекает группа высокоочищенных тимусных пептидов из семейства тимозинов. таких как тимозины а 1, а 7, Рз, Р 4По мнению большинства исследователей, основные регуляторные функции в дифференцировке Т-лимфоцитов осуществляет а 1 -тимозин, под действием которого образуются Тлф, несущие СД 4 маркер Тлф хелперы-индукторы).Таким образом а 1 -тимозин определяет иммунологические феномены, опосредуемые Т-хелперами-индукторами:тимусзависимая продукция антител; продукция у и а -интерферонов;выработка МИФ (фактор, ингибирующий миграцию лейкоцитов)синтез инртерлейкина - 2 и др.Кроме того, а -тимозин, стимулируя образования эритроцитарных рецепторов на лимфоидных клетках приводит к увеличению ауто Е-РОК, Механизм действия а 1 -тимозина заключается в экспрессии соответствующих рецепторов на предшественниках Т-хелп,инд.В последние гоДы доказана неоднородность данной субпопуляции Тлф и аргументирована ее центральная роль в обеспечении эффективной иммунной реакции клеточного или гуморального типа.В связи с вышеизложенным содержанием а 1-тимозина в сыворотке крови больных ХВГ "В" может рассматриваться как показатель состояния Т-клеточного иммунитета,В настоящее время диагностика вторичного иммунодефицитного состояния основывается на совокупности клиникоиммунологических показателей.Оценка иммунного статуса больного в клинике включает определение общего числа Тлф и основных субпопуляций Тлф хелперного и супрессорного типов.Тест роэеткообразования с эритроцитами и на сегодня является несомненного надежным и весьма распространенным в клинической практике.Оценку субпопуляций Тлф хелперного и супрессорного типа проводят также с использованием розеточного теста по наличию поверхностных Р, рецепторов для АМ и 90 (Т и Т лимфоциты) или, чаще всего,по чувствительности роэеткообразующихклеток к теофилину (ТФР и ТФЧ лимфоциты).Все перечисленные методы являютсятрудоемкими, требующими дорогостоящих5 и дефицитных реагентов, реактивов, содержания лабораторных животных, Кроме того,для получения взвеси моноклеаров необхо-.дим большой объем крови (3 мл), которыйможно взять только путем венепункции. Ме"0 тоды субъективны, так как счет ведется визуально, в связи с чем возможны погрешностисчета,В последнее время используют моноклональные антитела для определения общего числа Тлф и субпопуляций в методахиммунофлюоресценции и цитотоксическомтесте.Однако метод имеет также недостатки,связанные с потерей числа Т 8 субпопуляции20 лимфоцитов, возникающей при выделениимононуклеаров из периферической крови.Это приводит к изменению соотношенияТ 4/Т 8, не отражающему истинноо положения вещей.25 Целью изобретения является повышениедостоверности, за счет установления нового высокоинформативного показателя иммунологического статуса, а именноуровня а 1 -тимозина,в сыворотке крови, при отклонениях которогоот пределов физиологической нормы (от 831 до1475 пг/мл) у детей, больных ХВГ "В" диагностируют вторичный иммунодефицит.Установлена связь содержания а 1 -тимозина явлением вторичного иммунодефицита при хронической НВ-вирус инфекции,подтвержденного другими иммунологическими показателями в сопоставлениис характером клинических проявлений,Способ осуществляется следующим об 40 разом.Создана тест-система на основе поликлональных (кроличьих) антител. В основесистемы использован метод конкурентного(ИФА), иммуноферментного анализа, когда45 АГ жидкой фазы конкурирует за связь с АТ,находящимися в комплексе с АГ твердойфазы.Для построения референс-ряда бралишесть различных концентраций а 1 -тимозина от 0,1 нг/мл до 3,2 нг/мл. Контрольнымислужили пробы, не содержащие антигена иантител. Рабочее разведение сывороткикролика (1 АТ) 1;10000. Обязательным условием реакции связывания между АГ и АТбыла продолжительная инкубация при температуре 4 С. Для предотвращения неспецифического связывания АТ в отмывочныйраствор фосфатного буфера и в смесь АГ+АТдобавляли 0,1 ообъема детергента твин.5055 Р еакцию тестировали добавлением антикроличьих антител (2 АТ) фирмы "Я 9 гпа", коньюгированных с пероксидазой в рабоче" разведении 1;2000, хромогена-ортофенилендиамина и субстрата 30% перекиси водорода. Счет реакции производили на мультискане фирмы "ГОю" по уменьшению Сигнала оптической плотности при 450 нм в Сравнении с контрольной пробой, не содержащей специфического антигена. Продолсительность опыта от начала реакции до считывания составляет 40 ч,Одновременно в реакции могут быть исследованы 32 пробы сывороток крови. Ниже подробно излагается методика определения уровня а 1 -тимозина с помощью тест- Системы методом конкурентного ИФА.Порядок работы.Подготовка необходимых реактивов и г риборов;фосфатный буфер или раствор Хенкса, Ма-фосфоцитратный буфер, ортофенилендиамин,30%-ный раствор перекиси водородэ, твин, кроличьи антитела в разв. 1:1, (ф -тимозин, коньюгат антикроличьих антител с пероксидазой хрена, пробы сывороток для исследования;рН-метр, термостэт, холодильник, автол 1 атическая пипетка-дозатор с наконечникаМи, высокосорбционные 96-луночные пластины фирмы "МипК", "тЮечтеМ", планеты для иммунологических исследованийедполимер",мультискан,Постановка опыта;Фиксация а 1 -тимозина (АГ) на твердой даче для последующей инкубации: на 96-лунрчную высокосорбционную пластину наносили по 100 мкл в лунку раствор а 1 -тимозинэ в,концентрации 1 мкг/мл, в контрольный ряд наносили по 100 мкл в лунку раствор фосфатнго буфера, пластину герметически закрывали пленкой "парафилм" им инкубировали в течение 18 ч при 4 С в холодильнике;создание рефенс-ряда; в четыре ряда планшета "Медполимер" наносили по 50 мкл в лунку раствор а 1 -тимозина в концентациях 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1)6; 3,2 мкг/мл и кроличьи антитела в разв. 1:100000 по 50 мл в лунку, в смесь добавляли 0,1% объема тин;получение смеси тестируемых сыворотбк и кроличьих антител (АГ+АТ): в остальне восемь рядов планшеты "Медполимер" наносили сыворотки больных в разведении 1:4 по 50 мкл в лунку и кроличьи антитела в разведении 1;10000 по 50 мкл в лунку с дсбавлением 0,10 объема твина; планшету также герметически закрывали и инку 5 10 15 20 25 30 35 40 45 бировали в течение 18 ч при 4"С в холодильнике;перенос смеси АГ+АТ на твердую фазу: пластину 3-кратно отмывали от несвязавшегося а 1 -тимозина раствором фосфатного буфера с добавлением 0,1объема твина, на ледяной бане переносили инкубированную смесь стандартных растворов а 1 -тимозина и исследуемых сывороток с кроличьими антителами на твердую фазу высокосорбционной пластины "йцпве", пластину герметизировали и инкубировали в течение 18 ч при 4 С в холодильнике;добавление в реакцию двух антител (конъюгата) антикроличьих антител, с пероксидазой в рабочем разведении 1:2000 с добавлением 0,10 объема твинананосили на предварительно 3-х кратно отмытую от непрореагировавших комплексов АГ+АТ пластину "Напав"тестирование реакции: готовили, раствор ортофенилен диамина, для чего 10 мг вещества растворяли в 10 мл Иа-фасфоцитратного буфера рН 4,6; затем в раствор добавляли 4 мкл 300 -ного раствора перекиси водорода, являющегося для пероксидазы; после 3-х кратного отмывания пластины в лунки наносили по 100 мкл смеси субстрата и хромогена; счет реакции производили на мультискане при длине волны 450 нм;определение количественного содержания а 1 -тимозина.По коэффициенту поглощения ОД) референс-ряда стандартных растворов а 1- тимозина) строили калибровочную кривую, с помощью которой графически находили соответствующее количество гормона в исследуемой пробе сыворотки, умножая на кратность разведения сыворотки.Достоверность метода проверили при исследовании аналогичных стандартов гормона и одинаковых проб сывороток в радиоиммунном методе с использованием меченногоа 1 -тимозина. Средний уровень а -тимозина в сыворотке крови здоровых детей составил 1152 + 161 пг/мл. Статистическую обработку показателей проводили с использоьанием критерия Фишера-Стьюдента (табл.1).Пределы физиологической нормы а 1- тимозин были определены при вычислении среднего арифметического значения .ф. 2 гп (т.е, от 831 и г/мл до 1475 и г/мл), одновременно с другими иммунологическими показателями у 24 здоровых детей. Для исследования требуется 0,3-0,5 мл лрови, которуюю можно забирать из пальца,Частота регистрации при различных овнях а 1-тимозина,1 1,0+6,4 Р 1,2-3 Р 1,2-3 Р 1,2-3 Р 1,2-3 Р 0,05 Клинико-лабораторному обследованию подвергались 137 детей, страдающих ХВГ "В" (ХПГ), Исследования проводились неоднократно в динамике заболевания.Определение уровня а 1 -тимозина в сыворотке крови проводили до начала лечения параллельно с оценкой иммунного статуса. При анализе полученных результатов установлено, что содержание а 1-тимозина в сыворотке крови менее 831 пг/мл и более 1475пг/мл свидетельствует о вторичном иммунодефиците, что полностью подтверждает клинико-иммунологические показатели.Кроме того, при сопоставлении уровня а 1 -тимозина и иммунологических показателей у больных ХВГ "В" (ХПГ) отмечена зависимость характера иммунодефицита от уровня а 1 -тимозина. Так, при содержании а 1-тимозина ниже границ физиологической нормы явления вторичного иммунодефицита не сопровождаетСя нарушением физиологического соотношения регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (Т 4/Т 8).С другой стороны при отклонении содержания й 1 -тимозина выше нормы явления вторичного иммунодефицита сопровождается относительным десицитом Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов, Таким образом, отклонения уровня а 1 -тимозина от нормы свидетельствуют не только о наличии вторичного иммунодефицита, но и характеризуют тип иммунодефицита, что в конечномитоге определяют выбор схемы иммунокоррекции (табл.2).Предложенный способ подтверждается примерами, приведенными в табл.3,Приведенные данные свидетельствуюто высокой информативности предлагаемогоспособа диагностики с использованием нового иммунологического показателя а 1 -ти 5 моэинэ. Преимуществом данного способаявляется его объективность, в то время какдругие методы субъективны счет ведетсявизуально). Он также не требует дорогостоящих реагентов, реактивов и содержания10 лабораторных животных, Для осуществления способа необходимо небольшое количе-,ство крови (0,5 мл), которую можно забиратьиз пальца. Кроме того, с помощью этогоспособа осуществляется диагностика типа15 вторичного иммунодефицита, что определяет выбор схемы иммунокоррекции,Предлагаемый способ может быть рекомендован к применению в детских инфекционныхх стационарах, что будет способствовать.20 применению адекватных схем иммунокорригирующей терапии и тем самым выздоровлению больного или стабилизациипроцесса,Формула изобретения,25 Способ диагностики вторичного иммунодефицита при хронической НВ-вируснойинфекции у детей путем исследования крови пациента и определения диагностического показателя. о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,30 с целью упрощения способа, в качестве диагностического показателя используют уровеньа 1 -тимозина, который определяют вреакции иммуноферментного анализа в сыворотке крови и при значении измеренного35 показателя менее 831 пг/мм или более 1475пг/мм сыворотки крови диагностируют вто, ричный иммунодефицит.1802329 10 Таблица 2 Иммунологические показатели детей. больных ХВГ в (ХПГ) в зависимости от уровня а 1 тимизинаа блиц лезин Фазацесса Датаобсле эрастни,Уровень тСаша А б 4 марта 32 ООпг/мл 38 55 0,89 3 годаН 1141,вялотекущпроцессАпт 7,2Аст 3,86 13,3 ист.1987 14 апреля Выписан на 57 дегоспитализации.Ремиссия сохраняв течение 3 мес,далее - вялотекущпроцесс в течени 87 пг/ил 7 мес,Выписан на 35 дегосп, в связи сступлением ремиссохранявшейся втеч, 4 нес,Дагее - вялотекущпроцесс 560 пг/ 6 апрел 9 0.8 вялотекущийпроцессАпт 10,1Аст 4,2Б 9,2 Зг. 11 мес, ист.б-ни Н 1358, 1988 г. аииРоман К.8 лет,нст,б-ни Н 1557,1987 г. вялотекущийпроцессАпт 7,6.Аст 3,26 5,1 75 2009,5 рел Выписан госпита фазе ре сохраня ееч, ия 61 4 Г 1 1,3 июня реииссияАпт 05Аст 0 26 5,1 пг/ил Составитель И,ПоповаТехред М.Моргентал Корректор М.Керецм едактор В.Трубчен НТ СССР Подписноепо изобретениям и открытиям35, Раушская наб., 4/5.Гагарина, 10 изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгоро начало реииссииАпт 1,5Аст 4,26 9,2 Заказ 847 Тираж В Н И И ПИ Государствен ного комитет 113035, Москва, на 35 де изации в миссии, вейся в ода набл