Способ определения гамма-интерферона в лейкоцитах человека

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1802328 А 51)5 О 01 й 33 ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССРГСЗСПАТЕНТ СССР) ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ К АВТО(71 Ленинградский научно-исследовательск й институт детских инфекций(57 Изобретение относится к медицинскойвирусологии, в частности к способам определения лейкоцитарного человеческого интерферона. Целью изобретения являетсяповышение чувствительности определенияга м 1 ма-и нтерфе ро на в лей коцитах детей. ения ироет на т исирус иты в е 4 - 6 течением нием туре олося в рфеся к медицинскои к способам опречеловеческого инявляется повышеределения гаммаах детей,Поставленная цель до в из 1 вестном способе с по интрферона - вируса гри симго в культуру лимфоц нейнего их культивирова илиигла с 10 аутоплаз бретению индуктор - ви внеения в культуру отмы рез 4-6 ч культивируют кл при, температуре 40 С, раствор цистеина на 2-2 уда ения клетки выдерж 18- 4 ч при температуре 30 - 33ных средах с рН 8,0-8,2. следующим обИзобретение относи вир сологии, в частности дел ния лейкоцитарного тер ерона.Целью изобретенияниечувствительности о интерферона в лейкоцит стигается тем, что мощью индуктора ппа А/РР/8, вноитов детей и дальния в среде 199 мы, согласно изорус гриппа после вают от клеток чеетки в течение 4 ч затем добавляют 5 ч, а после его ивают в течение Цель достигается тем, что для выявл максимальных концентраций продуц ванного "ин витро интерферона" в отв вирусный интерфероноген предлагаю пользовать в качестве последнего в А/РР 8/Н 1%1, культивировать лейкоц присутствии вируса при 37 С в течени ч с дальнейшей индукцией при 40 С в ние 2 - 2,5 ч и последующим добавле раствора цистеина на 2 - 2,5 ч с выделе клеток в течение 18 - 24 ч при темпера 30 - 33 С после удаления последнего. П жительный эффект способа заключает возможности определения гамма-инте рона у маленьких детей. Культивирование лейкоцитов после индукции вирусом. гриппа проводят при температуре 40 С, что увеличивает скоростьсинтеза информационных РНК как для альфа-, так и для гамма-интерферона.Вводимый в реакцию раствор цистеина0,15-0,2- меняет структуру гликопротеидовмембран лимфоцитов, способствуя выходуболее высокомолекулярных белков.Понижение температуры и изменениерН в сторону 8,0-8,2 дифференцирует выходиз клетки гамма-интерферона по отношению к альфа-интерферону,Вновь введенная совокупность признаков дает возможность выявлять способность продуцировать "ин витра" иммунныйинтерферон в ответ на вирусный интерфероноген, что обеспечивает более ранний иповышенный выход количества гамма-интерферона лейкоцитов.Способ осуществляетсяразом, 1802328У ребенка берут кровь в гепарин в объеме 0,4 мл,(из вены или лучше иэ пальца),выделяют клетки белой крови центрифугированием при 1000 об/мин в течение 15мин, разводят из расчета 100-200 тыс. в 0,4 5мл (2,5 х 105), вносят вирус гриппаА/РР/34/Н 1 М 1/из расчета 50-1003 ИД 5 о.:на клетку и культивируют в течение 4 - б ч всреде Игла (или 199) с 100 аутоплазмы, несодержащей собственного интерферона, 10температура инкубации в этой стадии37"С. Далее лейкоцитарную взвесь отмывают от неадсорбированного вируса центрифугированием в указанных вышеусловиях, разводят в аналогичной средебеэ вируса и помещают на 4 ч в термостатпри температуре 40 С. Спустя указанноевремя и культуре лейкоцитов добавляют0,15-0,2% раствор цистеина, взвесь выдерживают 2,0-2,5 ч при температуре 40 С, 20осаждают клетки, ресуспендируют их в среде Игла с 10 аутоплазмой и культивируютв дальнейшем 18 - 24 ч при температуре 30 -33 С при рН = 8,0 - 8,2.Предлагаемый способ по сравнению с 25прототипом имеет следующие существенные отличия. Полученная после постановкипредлагаемым способом индукции интерферона в лейкоцитах детей вирусным индуктором интерферона (25-36,5 ч 30индукции) надосадочная жидкость послеи н а кт ива ции остаточного вируса - индуктора антисывороткой - содержала температурно- и кислотолабильный интерферон,инактивирующийся к гамма-интерферону. 35Имеет место принцип получения такого интерферона (с активностью 200-2000 МЕ) сприменением ряда новых, отличных от прототипа методических отличий, т.е. 4-х часовое инкубирование при температуре 40 С 40ведет к более выраженному синтезу и РНКи белка, причем время инкубации ограничивает выход основной массы синтезируемогок этому времени интерферона,Добавление препарата аминокислоты - 45цистеина по известным нам причинам усиливает выход гамма-интерферона за счетизменения пространственной конфигурации гликопротеидов мембран, меняющих еетранспортные характеристики, 50Последующее инкубирование праймированных лейкоцитов при температуре30 С в условиях рН 8,0 - 8,2 менее разрушаетвыходящий из клеток у-интерферон,Преимуществами предлагаемого способа получения ин витро гамма-интерферонаявляется ряд важных моментов, Во-первых,при необходимости обследования ребенкана способность его лейкоцитов продуцировать гамма-интерферон трудно получить ощутимые количества этого типа интерферона, так как используется минимальное количество лейкоцитарных клеток (2-5 х 105) мл. Как индуктор интерферона в такого рода исследовании (на определение интерфероногенного статуса по гамма-интерферону) целесообразно использовать вирус, могущий инфицировать человека, но не актуальный в настоящий период, в этом случае мы более приближаемся к истинным показателям в отличие от использования различных лектинов или энтеротоксинов грамм-положительных или токсинов грамм-отрицательных бактерий,Штамм вируса А/РР/8 явился в разрабатываемом способе наиболее сильным интерфероногеном из группы вирусов гриппа, испытанных нами, Во-вторых, использование температуры 40 С в начале индукции более отражает условия синтеза и-РНК (для гамма-интерферона) и самого интерферона при инфекционном процессе у детей с наличием выраженной лихорадки. В то же время ряд методических приемов, хотя и не отражают условий инфекционного процесса, однако способствуют максимальному синтезу и выходу этого типа интерферона.П р и м е р. У ребенка В.И; при определении интерферона по прототипному способу титра интерферона в культуре лейкоцитов в его крови на 1 сут 1;40; 2 сут 1:80; 3 сут 1;80, По тестам на гамма-интерферон при обработке рН титры его стали соответственно 1:40, 1;80, 1:10, однако после обработки антисыворотки к альфа-интерферону его активность резко упала до1:10, 1:10, 1;10,При определении интерферона по заявляемому способу титры были соответственно 1;320, после обработки рН 5,0 1;10, сыворотка к гамма-интерферону снимала активность интерферона до 1:10, при обработке сыворотки к альфа-интерферону 1:320,Значимость предлагаемого способа выявления гамма-интерферона при его индукции в лейкоцитах не вызывает сомнений, При возможном лечении интерфероном различных вирусных инфекций выяснение интерферонового статуса, т.е. наличие в крови различных типов интерферонов, а также способности лейкоцитов к их продукции крайне важно для определения оптимальных схем интерферонолечения. Кроме того, изучение интерферонового статуса необходимо при различных иммунодефицитных состояниях (включая СПИД), где. страдает, главным образом, функция синтеза гаммаинтерферона, как основного интерферонового иммуномодулятора иммунитета1802328 логическим тестированием в ней активности гамма-интерферона, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности определения гамма-интеоФерона в лейко цитах детей, в качестве ьндуктора используют вирус гриппа штамма А (РР 8), культивирование в присутствии вируса проводят при 37 С в течение 4 - 6 ч, далее лейкоциты отмывают от неадсорбированного 10 вируса и инкубируют в питательной средепри 40 С в течение 4 ч, после чего в среду вносят 0,15-0,20-ный раствор цистеина и дополнительно инкубируют при 40 С в течение 2,6-2,5 ч, отмывают, культивируют в пи тательной среде при температуре 30 С, рН8,0-8,2 в течение 18-24 ч,организма. Особенно важно значение разработанного способа для определения гамма-интерферона у маленьких детей, учитывая необходимость взятия минимального количества крови, а также роли интерферона в системе гормонов роста, регулирующих рост и развитие ребенка,Формула изобретения Способ определения гамма-интерферона в лейкоцитах человека путем выделения лейкоцитов из крови, ресуспендирования в питательной среде, внесения в среду индуктора - вируса гриппа, культивирования ин-. дуцированных лейкоцитов с последующим отделением культуральной жидкости и биоСоставитель П.Бонарцев Редактор В.Трубченко Техред М,Моргентал Корректор М,КерецманПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 847 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5