Способ получения ремантадинзависимого варианта вируса гриппа

(5ОСУДАРСТОЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ 12 й 7/ О,С 1 ПРИ ГКНТ СССРСП ИСАН И Е ИЗО БР ЕТЕ Н ЙЯ .К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1, : .: . 2(71) Белорусский научно-исследовательский, (57) Использование: вирусология, изучениеинститУт эпидемиологии и микРобиоЛогии, г .: ПРоценссов иэменчивбсти виРУсов под влиа(72) Е, И. Бореко, Н. И, Карако, В, И. Вотяковнием химиопрепаратов. Сущность изобреи П. Г, Рытик.; тения. в поддерживающуюсредудобавляют(56) Бореко Е; И,и Каракой;И,Перспективы рибавирин в концентрации 3-25 мкг/мл.развитйя химйи каркасных соединений и их" . 1 табл,применение о народном хозяйстве. Всес.конф., 19-21 апр. 1989, тезйсыдокл., Куйбы.шев, 1989, с. 7,Вотяков В. И., Бореко Е. И., ЗапорожецЛ, К. Судник Ю. М. Нуклеозиды; производные бициклогептана и адамантаа и другиеинтивирусные вещества. Минск, 1981,с, 3-9.л СаГИзобретениеотйосится к вирусологии и . дйфференциация этих вариантов от родиможет быть использовано, например, в изу-,; тельских вирусов,ченйипгроцессооизменчиоостйвирусовпод, . В то же время ремантадинзависимыйвлияйием химиопрепаратов;,:,. вариант вируса грипйа малостабилен, легко (ЛВозможность возникновения химиоп- . ревертирует при пассировании на клеточ- ърепаратзаоисимых оариантоо оирусов хоро- . ной культуре в отсутствии ремантадина, его )шо известна йз истории химиотерапиил дифференциацияот родительского вируса рвирусных инфекций о связи с такими высо-, затруднена, особенно при высокоймножекоэффектионымй препаратами как произ- ственности инфицирования. Это в свою очеводные бксибензилбензимидазола. редь не позволяет получать большиегуанидина, изатинЬ.тиосемикзроазонв. Эа коаичестаа ремантадиензееисиглогоаирусз. 1)висимые варианты вирусов о пртлсутствии Известен способ получения ремантади-аэтих веществ могут быть легко пояучейы в ензаойсимого(измененного) варианта оируколичествах, достаточцых для большинства са, заключающийся в том, что монослойнуюбиохимических и биофизических йсследова- тканевую культуру фибробластов эмбрионий. Это связано с относительно высокой ноо кур (ФЭК) инфицируют 0,00002стабильностью о ходе пассирования, что БОЕ/клетка вируса гриппа А/РРЧ/Востосс,приводит о итоге к практически полной ги- покрыоа от питательной средой на основебели варианта вируса в отсутствии кимиоп- концентрата среды 199 с добавлением 1репарата, Следовательно, возможна четкая бактагара и 0,005-нейтрального красного,устанавливают в лунку, вырезаннуа в покрытии после затоердевания, отрезок стеклянной трубки и заполняот ее просвет 0,05 мл раствора ремантадина (5 мг/мл), инкубируют в 5 СОг атмосфере при 37 С о течение 48 ч, Препарат ремантадиензаоисимага варианта вируса получают путем "выкалыоания" бляшек, образовавшихся на чашке в непосредственной близости округ зоны токсичности и отделенных от бляшек роди 10 тельского вируса зоной подавления образования бляшек. Недостатком способа яоляется малое количество вируса в препарате, Попытка повысить множественность инфицирования для увеличения выхода приводит к образооанию сливных бляшек и невозможности их четкой дифференциации вследствие исчеэновения зоны подавления образования бляшек. Способ имеет скорее демонстрационное, чем препаративнае значение. Накапливание с его помощью количества вируссодержащега материала, необходимых, например, для электронной микроскопии, электрофоретического исследования 25 компонентов вибрионов практически невозможно,Наиболее близким к изобретению является способ получения ремантадинзависимого варианта вируса путем инфицирования монослойной культуры ФЭК 0,0001-0.001 ТЦД 50/клетка вируса гриппа . А/ЕРЧОоз 1 асК нанесения паддеркиваощей среды(среда 199) с растворенным в ней 6-25 мкг/мл ремантадина, инкубации в течение 48 ч при 37 С и сбора культуральнай жидкости как материала, содержащего необходимый вариант вируса. Способ позво 35 ляет. получить более значительные количества ремантадинзависимого вариан 40 та вируса, который может быть подвергнут дальнейшей обработке с помощью обычныхприемоо очистки и концентрирования вируссадержащего материала,Недостатком способа является малый выход ремантадинзависимого варианта вируса. Это связано с плохой дифференциацией эого варианта от родительского(инфицирующего) вируса, основанной только на вирусингибирующих свойствах испальзованных и более низких концентраций рерус. Ингибирующее действие ремантадина недостаточно в этих условиях как разделямантадина в отношении, инфицируащего вируса. Если же создаются условия для получения материала в больших количествах (задается высокая множественность инфек . ции), становится невозможным разделение, поскольку размножаются оба - ремантадинэависимый вариант и родительский оиащий (падалляааий размнаение родительского вируса) фактор. В связи с. этимвозможна только низкая глнажественнастьинфицирования, чта недостаточно для некоторых видов исследования, напримеравтарадиографическаго изучения инфицированных клеток в течение первого цикларепродукции вируса. Кроме того, невозможно накапливание ремантадинзаоисимогооарианта при инфицирооании вирусом, устойчивым к дейстоио ремантадина, так какоирусингибирующие соойвтва о отношенииродительского вируса и, следовательно,дифференциация материала от исходныхчастиц ослаблены.Целью изобретения яоляется увеличение выхода и пооышение однородностиполучаемых препаратов ремантадинзависимаго варианта вируса гриппа,Поставленная цель достигается добавлением в поддержиоающуо сроду ремантадина в концентрации бмкг/мл ирибавирина о концентрации 3 - 25 мкг/мл.Новизна изобретения заключается осочетаннам использовании ремантадина ирибавирина для получения ремантадинзависимого варианта вируса, было известно,что ремантадин и рибавиринпри совместном использовании проявляют синергидный ингибирующий эффект на размна;кениевирусов гриппа, Не было известна и явилосьнеожиданным отсутствие ингибирующегоэффекта рибаоирина в отношении ремантадинзависимого варианта оируса при егополучении в условиях одновременного присутствия ремантадина и рибавирина о средеподдержки. Нельзя было предполагать оозможность образования ремантадинзависимого варианта вируса в присутстоии.ремантадина и рибавирина. Напротив, име. ющиеся данные свидетельствуют о затрудненном образовании даже устойчивостивируса гриппа к комбинации ремантадин +рибавирин вследствие разнопланаоостиспособа антивирусного дейстоия обоих ин- .гибиторов.Положительный. эффект изобретениязаключается в повышении надежности дифференциации материала ремантадинзависимого варианта вируса от родительскоговируса, что позволяет значительна увеличить множественность инфицирования иполучить таким образом высокий урожайпри инфицирооании тканеоой культуры даже оируссом, устойчивым к действию ремантадина.П р и м е р 1. Монослайнйе тканевыекультуры ФЭК инфицируют 0,01 БОЕ/клетка вируса гриппа А/ЕРЧ/Воэтосй и его варианта; устойчивого к действию ремантадина..1 751 204 56После 1 ч контакта с клетками вируссодер- с рибавирийом ЦПЭ отсутствует так же, как жащую жидкоСтьудаляют и:наносят свежуюи вприсутствйй только одногорибавирина среду поддержки (среда 199) с растворен-" (строки 4 - 6, колонки 3 - 4), Этосвидетельстными в ней ремантадином и рибавирином в вует о том, что в "условиях присутствия в концентрации 25 мкг/мл. После 48 ч инкуба поддерживающей средеремантадина и риции при 37 С учитывают цитопатический бавирина одновременно происходит полэффект (ЦПЭ) вирусов под малым увелйче-ное подавление размножения исходного нием (х 80) микроскопа. Полученные резуль- (йнфицирующего) вируса при свободном татй сводят в таблицу . размножений ремантадйнзависимого вариКак видно из представленных результа анта вируса в том жедиапазоне концентратов; при инфицированиитканевой культуры . ций ремантадина, который отмечен как вирусом А/ГРЧ/йозтосМ зарегистрирована диапазон образования ремантадинзависи. 100 О-ная выраженность ЦПЭ (строка 6, ко-: мого вариайта вируса при использовании лонка 9 в таблице). Такая же выраженность только"одйогоремантадина.ЦПЭ отмечена в присутствии 6-25 мкг/мл 15 При совместном использовании реманРемантадина при инфицировании этйм же тадина и рибавирина в диапазоне концентвирусом(строки 1-3, колонка 9).Частичное раций ремантадина 6-25 мкг/мл имеет подавление развития ЦПЭ отмечено в при-место менее высокая выраженность ЦПЭ в сутствйй 0,7 и 0,1 мкг/мл ремантадина сравнении с группами, в которых присутст- (строки 4 и 5, кблонка 9).20 вовал только одйн ремантадин в этих же,Таким образом, концентрации реманта-концентрациях (строки 1 - 3, сравнивают кадина 6-25 мкг/мл соответствуютдиапазонулойки 3, 4 и 9; 10). Эти данные отражают образования ремантадинзависимого вари- подавление размножения части популяции анта вируса, а более низкие его концейтра-" вирусного потомства,соответствующей исции - диапазону подавления размножения 25 ходному (инфицйрующему) вирусу в условиисходного вируса; Вследствие относитель- ях сочетанного использования ремантадинано высокой множественйости инфицирова- и рибавирина.ния полное подавление размножения Пример иллюстрирует воэможность исходного вируСа в концентрациях 0,7 и 0,1 четкой дифференциации ремантвдинзавимкг/мл ремантадина не наблюдается. В 30 симого варианта вируса гриппа от исходно- связи с этим неисключается возможность . го(инфицирующего) вируса в условиях как появления в присутствии более высбкйх повышенной множественности инфицироконцентраций (6-.25 мкг/мл) смешанной по-вания, так и при использовании реман 1 адипуляции вирусного потомства вкоторой йа- нустойчивого варианта вируса в качестве ряду с частицами ремантадинзависимого 35 инфицирующего путем комбинации 6-.вариайта вйруса -присутствуют частицы, 25 мкг/мл ремантадина с 25 мкг/мл рибавиструктурно и функционально соответствую- рина.щие частицамисходного (инфицирующего) П р и м е р 2. Ойерации по способу, вируса. - изложенному в примере 1, выполняют сЕсли инфицирование тканевой культу 12 мкг/мл рибавирина. Отмечают полноеры выполняют вирусом А/РРЧ/йоз 1 осК ус- подавление размножейия исходного вируса " тойчивым к действию ремантадина, в присутствии 0,7 и 0,1 мкг/мл ремантадина выраженность ЦПЭ в присутствиивсех кон- (строки 4 и 5; колонка 5 в таблице) и частичцентраций ремантадина достигает конт- ное без ремантадина (сравнивают колонки ральной, 100;( (колонка 10 в таблице). 45 5 и 9 в строке 6), В результате более четко Следовательно, в этом случае какая-либо га- . проявляется диапазон образования реманрантия соответствия концентраций реман- " тадинзависимого варианта вируса (25- тадина 6-25 мкг/млдиапазонуобразования 6 мкг/мл, строки 1 - 3, колонка 7). Если ремантадинзависимоговариантавирусаот-инфицирование проводят вирусом гриппа, сутствует. 50 устойчивым к действию ремантадина, поВ то же время, при инфицированиидавление размножения вируса отмечаюттканевой культуры как вирусом только в пределах диапазона образования А/РРЧ/Воз 1 осК так и его вариантом,уСтой- . ремантадинзависимого варианта вйруса, но чивым к действию ремантадина, одновре- не в более низкихконцентрациях(сравниваменное присутствие ремантадина"и 55 ют колонки 8 и 10), Сам по себе рибавирин рибавирина (25 мкг/мл) приводит к прояв- в заданной концентрации не обеспечивает лению ЦПЭ только в диапазоне концентра- антивирусного действия в отношении реций ремантадина 6-25 мкг/мл (строки 1-3, мантадинустойчивого вируса.колонки 3-4). В присутствии ремантадйна в" Пример иллюстрирует возможность более низких концентрациях в комбинации дифференциации реман 1 адинззвисимого7 1751204 8варианта вируса от исходного(инфицирую- Мтрис-НО рН 8,8 (разделяющий гель). Вщего) вйруса, чувствительного к действию качестве фокусирующего геля используютремантадина, путем комбинации 6- 5% акриламид в 0,125 М трис-НС рН 6,8.25 мкг/мл ремантадина с 12 мкг/мл рибави- После разделения белков гель высушиваютрина, и недостаточность такой комбинации 5 й получают автографы на рентгеновскойдля дифференцйацйи при испольЪовайии в: плейке обычным йутем,качествеисходного вируса, устойчйвого к Для определения принадлежности к редействию ремантадина.-майтадинэависимому варианту вируса исП р и м е р 3, Операции по способу, пользуют один иэхарактерных признаков,изложенному в примере 1. выполняют с 3 10 отличающих этот вариантотисходного(ин мкг/мл рибавирина. Отмечают полное по- фицирующего) вйруса"сниженное количедавление размноженйя исходйого вируса в ство М-белка и гемагглютинина и недостаприсутствии 0,7 и 0,1 мкг/мл ремантадина точное расщепление последнего,(строки 4 и 5, колонка 7 в таблице). Подавле-, . Добавление ремантадина в концентрание размножения вируса без ремантадина 15 ции 20 мкг/мл не приводит к проявлениюотсутствует (сравнивают колонки 7 и 9 в характерногопризнака"ремантадинэависистроке 6), В результатеболеечетко проявля- мого варианта вируса в сравнений свиру- .ется диапазон образования ремантадинза-сом, размножавшимся в отсутствиивисимого варианта вируса (25-6 мкгlмл, химиопрепаратов. В то же время впрйсутстроки 1-3,колонка 7).Еслиинфицирование 20 ствии ремайтздина в концентрациипроводят вирусом гриппа, устойчивым к 20 мкг/мл и рибавирина в концентрациидействию ремантадина, подавление 25 мкг/мл одновременно снижается плотразмножения вируса отмечаюттолько в ность негзтйва в области разделенияРфпределахдиапазонаобразованияреманта- .полипептидов с отйосительно низкой,динзависимоговариантавируса, ноневбо молекулярйой массой,М и НА 2, за счетлее низких концентрациях (сравнйвают уменьшения количества и неполного расколонки 8 и 10), Сам по себе рибавирин в щепления гемагглютинина. "заданной концентрации не обеспечивает Пример демонстрирует возможиостьантивирусного действия в отношении ре- использованйя комбинации ремантадина имантадинустойчивого вируса (сравнивают 30 рибавирина для дифференциации ремантаколонки 8 и 10 в строке 6).:динэависимого варйанта вируса от йсходноПример иллюстрирует возможность го при исследовании полипептидногодифференциации ремайтадййзавйсимого состава в условиях. высокой множественноварианта вируса от исходного (инфйцирую- сти инфицирования.щего) вируса, чувствительного к действию 35 Таким образом данное решениепоэворемантадина, путем комбинации 6-ляетдостигнутьпоставленнуюцель. Приис 25 мкг/млремантадинас 3 мкг/млрибави- пользовании комбинации 6-25 мкг/млрина, и недостаточность такой комбйнации ремантадина и 25 мкг/мл рибавирина удадля дифференцйации при использовании в ется получить увеличение выхода ремантакачестве исходного вируса, устойчивого к 40 динэависимого вариантавируса гриппа придействию-ремантадина; высокой множественности инфицирования,П р и и е р 4. Монослойные тканевйе а также в случае использования в качествекультуры ФЭКинфицируют 2-2,5 БОЕ/клет- исходного (инфицирующего) ремантадинука вируса гриппа А/ЕРЧ/ВозсосМ путем кон- стойчивого вируса. В том случае, если в катакта вируссодержащей жидкости с 45 честве исходного использован вирус,клетками в течение 1 ч, Неадсорбирован- чувствительный к действию ремантадина,ный на поверхности клеток вирус удаляют, дифференциацию ремантадинзависимогоклетки покрывают свежей средой 199 с вариантаудзется получитьи прииспольэо-растворенными в ней ремантадйном, рибз- вании комбинации 6-25 мкг/мл реманеирином или обоими химиопрепаратами 50 тадина и 3-12 икг/мл рибавиринавместе. Через 1 ч инкубации при 37 С в Для дифференциации ремантадинзависисредуподдержкивводят 25 мКи/мл 140-гид- мого вируса при использовании в качестверолиэата хлореллы. СпуСтя еще 5 ч инкуба- инфицирующего ремантадинустойчивогоции при 37 ОС монослой лизируют в буфере . вируса такая комбинация недостаточна.образца (2 додецилсульфата натрия, 5 55, Следовательно, при оптимальном соче;2-меркаптозтанола, 0,05 М трис-НО рН 6,8, тании концентраций двух химиопрепаратов5 глицерина, 5 мг/мл бромфеноловогоси- становится возможным накапливание ренего), прогревая при 100 С в обьеме 150-мантадинзависимого варианта вируса и ис 200 мкл, Электрофорез белков проводят в пользование для его изучения методов,125-ном полиакриламидном геле на 0,275 требующих высокой множественности ин. фицирования, Кроме того, о любом случае достигается более высокая однородность получаемых препаратов ремантадинзаоиси. мого варианта вируса, что споссбстоует получению более адекватных результатов. Влияние комбинации ремантадина + рибаоирин на развитие цитопатического эффекта вирусов гриппа о тканеоой культуре.всоси ЕРЧЙ - вирусна.2 м е ч а н и я: ЦПЭ выражен о процентах; ЕРЧ- вирус А/ЕРЧ А/ЕРИйозтосК устойчивый к дейстеию ремонт Составитель С.Стасснок актор Н.ШвыдкаяТехред М,Моргентал Корректор С.ПекарьЗаказ 2665 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 роизводстоенно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 10 Изобретение может быть использовано в исследовательской лабораторной практике для увеличения выхода (урожая) ремантадинзаоисимого варианта вируса гриппа.Учитывая имеющиеся сведения о распространенности явления образования химиопрепаратзависимых вариантов. вируса на целый ряд алициклических производных, обладающих противооирусными свойствами, следует ожидать столь же позитивного эффекта От применения комбинаций и этих веществ с рибаоирином.Формула изобретения Способ получения ремантадинэаоиси мого варианта вируса гриппа путем инфицирования клеточной культуры, последующего.введения ремантадина в состав поддержи.вающей среды в концентрации 6-25 мкг/мл и сбора материала после завершения инку бации, отл ича ющи й ся тем, что, с цельюувеличения выхода и повышения однород ности получаемых препаратов ремантадинзависимого варианта вируса. в состав поддерживающей среды дополнительно 15 вводят рибавирин в концентрации 325 мкг/мл.