Способ определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину

(54) ТЕЛ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИ К АВТОРСКОМУ С(56) Ворхунова Г.К., Тулькес С,Г., Букринская А,Г, Молекулярная генетика, микробиология, вирусология, 1983, М 2, с. 43-47,СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИЬНОСТИ ВИРУСА ГРИППА К РЕМАН- ТАДИНУ Изобретение относится к медицине; конкретно к способу определенИя чувствительности вируса гриппа к ремантадину,Различные варианты вируса гриппа обладают разной чувствительностью к химиотерапевтическим препаратам, Вирус гриппа В устойчив к амантадину и проявляет слабую чувствительность к ремантадину. Вирус гриппа А характеризуется выраженной чувствительностью к этим препаратам, поэтому они широко используются в профилактике и лечении гриппа, Однако не исключено появление вариантов вируса гриппа А нечувствительныхк ремантадийу. Поэтому в период массовых заболеваний гриппом целесообразно определять чувСТ- вительность конкретного варианта вируса гриппа, вызвавшего эпидемию,к ремантадину с целью рекомендации использования . или не использования препаратав профи-" лактике и терапии заболевания. 1751 б 68 А(57) Изобретение относится к медицине, конкретно к способу определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину. Цель изобретения - ускорение анализа и упрощение способа, В двухкамерную электрохимическую ячейку, разделенную бислойной липидной мембраной добавляют в одну камеру раствор белка исследуемого вируса гриппа, измеряют потенциал и при увеличении потенциала после добавления ремантадина вирус считают чувствительным к действию ремантадина, По сравнению с прототипом происходит сокращение времени аналйза снескольких часов до 2-3 мин и упрощается способ за счет использования электрохимической ячейки. Известно определение чувствительности вариантов вируса гриппа к ремантадину по ассоциации меченного матриксного белка (М-белка) вируса с липосомами в присутствии ремантадина,Недостатком известного способа является необходимость получения липосом, создержащих меченые С М-белки, меченого Н ремантадина, сложность и многоступенчатость процессов измерения.Наиболее близким предлагаемому способу является способ определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину с применением метода электрофореза. Инкубированный с ремантадином вирусный белок чувствительного к ремантадину и резистентного вариантов вируса гриппа, после предварительных процедур и подготовки к электрофорезу наносят на 10%-ный ПААГ. После проведения фореза окрашивали гель амидочерным, нарезали на полоскии растворяли в 30 оь-ном растворе перекисиводорода. Затем измерили радиоактивность проб, нанесенйых на бумажные мишени, Наличие метки Н, обусловленноймеченным тритием ремантадином, в пробах, отвечающих локализации М-белка,свидетельствует о связывании М-белка ремайтадина.,Налйчие такого рода ассоциаций характерно в случае чувствительного кремантадину варианта вируса. 10К недостаткам данного метода следуетотнести необходимость получения ремантадина, меченого тритием (что требует отработки специальной технологии всоответствующих условиях), необходимость 15проведения многочисленных операций поудалению не связавшегося Н-ремантаздина, трудоемкрстью процессов приготовления и последующей после форезаобработки геля, а также затратами времени 20на электрофореэ,Цель изобретения - ускорение анализаи упрощение способа,Способ осуществляют следующим образом, 25В один из отсеков измерительной ячейки установки для излучения электрическихсвойств бислойной липидной мембраны: (БЛМ) внбсят при йОстоянйом-йеремешивании вирусный М-белок. При этом регистрируют значение разности граничныхпотенциалов БЛМ, сформированной на отверстии тефлоновой перегородки, разделяющей отсеки, заполненные солевымраствором. Полученное значение принимается за начальную точку отсчета. После этого в тот же отсек добавляют ремантадин(при перемешивании) и регистрируют изменение граничного потенциала мембраныЛу. Результаты сравнивают со значением 40Лу,"йблученнйм в аналогичных условияхпри добавлении в ячейку той же концентрации ремантадина, но в отсутствие М-белка. "Если измеренные таким образом скачки потенциала близки или совпадают, это говорит о том, что вирус, из которого выделенМ-белок, устойчив к ремантадину. Превышение полученных значений Лр надконтрольнымй свидетельствует о чувствительности вируса к ремантадину, 50От прототипа способ отличается тем,что взаимодействие (связывание) М-белкэвируса гриппа с ремантадином определяютпо изменению разности граничных потенциалов БЛМ, которое наблюдается при ведении по одну иэ ее сторон в солевойраствор М-бЕлка и ремантадина.П р и м е р 1, Бислойную липиднуюмембрану (БЛМ) формировали по методу Мюллер, -Рудина в тефлоновой ячейке с двумя отсеками на отверстии диаметром 0,8-1 мм иэ деканового раствора (50 мг/мл) .-афосфэтидилколинэ фирмы Р 9 щэ . Водные растворы содержали 5 мМКС 1 и 5 мМКН 2 РО (марки ХЧ), рН 7,4.Вирусные М-белки выделяли из чувствительного и устойчивого к ремэнтадину штэммов вируса гриппа, Контроль чистоты и нативности М-белка осуществляли посредством электрофореза (пластинчэтого) в 10-ном ПААГ (полиакриламидный гель) в присутствии додецилсульфата натрия в течении 18 - 20 ч при силе тока 6 - 8 мА. М-белок не содержал примеси других белков, не менял своей электрофоретической подвижности, располагаясь в той же зоне, в которой обычно распределяется М-белок вируса.Измерения граничных потенциалов на БЛМ проводили методом компенсации внутримембранного поля (КВП) с использованием второй гармоники емкостного тока,С помощью этого метода регистрировали разность граничных потенциалов (Лр) с обеих сторон мембраны,В один из отсеков измерительной ячейки вносили при стабильном перемешивании вирусный М-белок (5 мкг/мл). При этом регистрировали значение разности граничных потенциалов БЛМ, сформированной на отверстии тефлоновой перегородки, разделяющей отсеки, заполненные солевым раствором, Полученное значение принимали за начальную точку отсчета, После этого в тот же отсек добавляется ремантэдин (при перемешивании) и регистрируют изменение граничного потеницала мембраны Лр Результаты сравнивают со знэчением Лр, полученным в аналогичных условиях при добавлении в ячейку той же концентрации ремантадина, но в отсутствии М-белкэ (контроль). Если измеренные таким образом скачки потенциала близки или совпадают, то вирус, из которого выделен М-белок, устойчив к ремантадину. Превышение полученных значений Лр нэд контрольными свидетельствует о чувствительности вируса к ремантадину. Для оценки чувствительности к ремантадину каждого данного варианта вируса гриппа достаточно внести по одну из сторон БЛМ в солевой раствор 5 мг/мл М-белка и 1 мМ рементэдина. О чувствительности вируса к ремэнтэдину будет свидетельствовать превышение более чем на 10 мВ значений скачков потенциалов вприсутствии М-белка над контрольными.Таким образом, предлагаемый способ обладает следующими преимуществами: позволяет существенно упростить процесс,1751668 Составитель В,ЛитовченкоТехред М.Моргентал Корректор Н.филь Редактор А.Долинич Заказ 2688 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 так как отпадает необходимость в нечетных радиоактивностью С М-белке и Н реман 4 з тадине, а следовательно, в необходимости специального оборудования условий для работ с радиоактивностью, Отпадает необходимость в проведении многочасового злектрофореза, Весь процесс измерения при наличии контрольной кривой занимает несколько минут.Формула изобретения СпОсоб определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину путем выделения белка-М ич вируса гриппа и инкубации белка-М в присутствииремантадина, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью сокращения времени и упрощений способа, измеряют 5 граничные потенциалы бислойной липидной мембраны после ее инкубации с белком- М и после инкубации в присутствии ремантадина и при увеличении потенциала мембраны более чем на 10 мВ в сравнении 10 с потенциалом после инкубации ее с ремантадином, определяют чувствительность виру: са гриппа к действию ремантадина.