Способ получения гиалуронидазы
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Текст
СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ 1723121 А ЕСПУБЛИ 5)5 С 12 И(57)гии,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) Авторское свидетельство СССРМ 974816, кл. С 12 М 9/14, 1980. Б ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИД Изобретение относится к биотехнолов частности к микробиологической проИзобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической промышленности, и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов для приготовления лекарственных средств,Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ, в котором продуцент гиалуронидазы - штамм Ятгерсоаусез асбпосЫцз 77 - выращивали глубинным способом, культуральную жидкость концентрировали вакуум-выпариванием при 40- 60 С и рН 7,5 - 8,5, фермент выделяли осаждением из культуральной жидкости 3 - 4 объемами этилового спирта. В результате получали препарат гиалуронидазы с активностьюю 450 - 800 М Е/г (колоримерический метод) и удельной активностью 7 - 10 МЕ/мг белка. мышленности, и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов для приготовленИя лекарственных средств, Цель изобретения - повышение активности и степени чистоты гиалуронидазы. Способ заключается в том, что штамм Я 1 герюгпусез асбпосЫоз 77 выращивают глубинным способом, фильтрат культуральной жидкости подкисляют до рН 4,4 - 4,6, осветляют и сорбируют на карбоксильном катионите КМп. Сорбент промывают и гиалуронидазу десорбируют щелочными растворами, затем элюат обесцвечивают активированным углем при перемешивании и уголь отделяют. Удельная активность продукта 60 МЕ/мг, степень очистки 30. 2 з, и. ф-л ы, 5 табл. Недостатками данного технического решения являются низкая активность и степень чистоты гиалуронидазы. юйЦель изобретения - повышение активности и степени чистоты гиалуронидазы.Штамм Ясгертогпусез асбпосдоз 77 выращивают глубинным способом на питательевеЬ ной среде определенного состава, фильтрат культуральной жидкости подкисляют 2 И соляной кислотой до рН 4,4 - 4,6, осветляют ф центрифугированием или фильтрацией исорбируют на карбоксильном катионите КМп (40 - 60 объемов на объем сорбента) со скоростью 50 - 100 мл/ч/см, сорбент2промывают 0,01 М ацетатным буфером рН 4,4 - 4,6, гиалуронидазу десорбируют щелочными растворами, затем элюат обесцвечивают активированным углем в концентрации 1,0 - 1,5% при перемешивании и уголь отделяют, Десорбцию можно прово 1723121дить либо в статических условиях при рН 8,5 - 8,7, либо в динамике растворами щелочи, аммиака или раствором фосфорнокислого натрия двузамещенного.В табл, 1 представлены данные по подбору условий сорбции гиалуронидазы из 1 л фильтрата культуральной жидкости на колонке с карбоксильным катионитом КМп объемом 20 мл (Ф = 1,1 см,= 5 см). Для сравнения приведены данные по сорбции гиалуронидазы на колонке тех же размеров с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) и некоторых других карбоксильных катионитах.Из табл, 1 следует, что из пяти испытанных карбоксильных катионитов только КМ 2 п практически полностью сорбировал гиалуронидазу. Сорбцию фильтрата культу- ральной жидкости на катионите необходимо проводить в интервале рН 4;4 - 4,6, при этом на стадии подкисления гиалуронидазная активность сохраняется на 60 - 70 ,при снижении рН до 4,2 гиалуронидаза инактивируется сильнее и активность сохраняется лишь на 50 . При увеличении рН до 4,8 количество фермента в "проскоке" достигает 15 , что уменьшает выход фермента,Важное значение имеет скорость сорбции фильтрата культуральной жидкости на катионите. Оптимальным является интервал 50 - 100 мл/ч/см, При уменьшении скогрости ферментный раствор при кислых значениях рН (4,5) длительное время сорбируется на колонку, что приводит к снижению стабильности гиалуронидазы, В результате увеличения скорости сорбции пропорционально повышается выход фермента в "проскоке" и соответственно снижается количество гиалуронидазы в элюате.Гиалуронидазу десорбируют различными щелочными растворами в статических условиях в воду путем сдвига рН или в динамических условиях путем пропускания различных элюентов через колонку с сорбентом,Данные по подбору условий десорбции приведены в табл. 2 (сорбцию фермента проводили в оптимальных условиях; рН 4,5, скорость 70 мл/ч/см ).Из табл. 2 следует, что десорбцию гиалуронидазы в статических условиях необходимо проводить при рН выше 8,5, при этом выход на стадии составлял 55-60 . Увеличение рН выше 8,8 приводило к элюции большого количества балластных белков, что вызывало уменьшение удельной активности в конечных препаратах (см. табл. 5),В табл. 3 приведены экспериментальные данные по подбору условий обесцвечивания растворов гиалуронидазы активированным углем, 5 10 15 Результаты опытов свидетельствуют о том, что при концентрации угля 1,0 - 1,5 происходит обесцвечивание раствора гиалуронидазы на 75 - 78 при сохранении активности на стадии до 85-90 , При снижении концентрации угля в растворе остается значительное количество пигментов, что отрицательно влияет на качество препаратов, Увеличение концентрации угля до 2,0 приводит к снижению выхода гиалуронидазы на стадии обесцвечивания,Схема получения гиалуронидазы попредлагаемому способу представлена втабл. 4.Как видно из табл. 4, предлагаемаясхема позволяет получить гиалуронидазу высокой степени очистки с удельной активностью 60 МЕ/мг белка и общим выходомфермента 35 ,20 П р и м е р (по прототипу), Продуцентгиалуронидазы Ятгертотусез асбпосЫоз 77выращивали в ферментере емкостью 250 л(заполнение 180 л) на среде, содержащей3/ гидролизата БВК, 0,8 сульфата аммо 25 ния. 0,1 К 2 Н Р 04. Аэрация в процессе культивирования дробная: первые 12 ч роста - 9м /ч, затем до конца культивирования 27м /ч, рН в начале культивирования 6,8,время выращивания 56 ч, По окончании30 выращивания мицелий отделяют центрифугированием, фильтрат культуральной жидкости (150 л) упаривали в 10 раз. Кконцентрату добавляли 4 объема охлажденного этилового спирта, осадок отделяли на35 нутч-фильтре и лиофилизировали. Получалипрепарат гиалуронидазы с активностью 450МЕ/г и удельной активностью 8 МЕ/мг белка,П р и м е р 1. Продуцент гиалуронидазы40 выращивали на той же питательной среде, втеж же условиях, что и в примере по прототипу, мицелий отделяли центрифугированием, Получали 150 л фильтрата культуральнойжидкости с активностью 13 МЕ/мл и удель 45 ной активностью 2,0 МЕ/мг белка, Фильтрат подкисляли 2 й соляной кислотой до рН4,5 и сорбировали на колонку (б = 12 см, 1=28 см) с 3,0 л карбоксильного катионита КМ 2 п кислотного гидролиза (биокарб К), урав 50 новешенного 0,01 М ацетатным буфером рН4,5, Скорость сорбции - 70 мл/ч/см, времягсорбции 19 ч. Катионит после сорбции переносили в емкость с мешалкой, дважды (по 3л) отмывали 0,01 М ацетатным буфером рН55 4,5, Гиалуронидазу десорбировали с катионита в статических условиях 7,5 л дистиллированной воды путем доведения рН дозначения 8,7 раствором 2 М едкого натрия,Перемешивали смесь 15 мин, элюат отфильтровывали через капроновую ткань, затем1723121выход фермента составляет 31-35 ф , а удельная активность достигается 49 - 60 МЕ/мг белка (примеры 4 - 6). Увеличение рН при десорбции больше 9,0 приводит к зна 5 чительному снижению удельной активностив препарате. Наилучшие результаты по десорбции гиалуронидазы в динамике получены при использовании 0,2 М раствора форсфорнокислого натрия двузамещенно 10 го, при этом удельная активность достигает70 МЕ/мг белка(пример 10). Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать фермент с высокой степенью очистки. По сравнению с примером-прототипом удель 15 ная активность гиалуронидазы выше в 7 - 9раз (примеры 4, 10).Формула изобретения1. Способ получения гиалуронидазы.20 предусматривающий глубинное выращивание продуцента Зтгертовусез асбпосбцз77, отделение мицелия, выделение фермента из полученной культуральной жидкости иочистку,отличающийся тем,что,с25 целью повышения активности и степени чистоты гиалуронидазы, культуральную жидкость подкисляют до рН 4,4-4,6, а очисткуфермента ведут сорбцией через колонку скарбоксильным катионитом КМп кислот 30 ного гиуролиза со скоростью 50 - 100мл/ч/см и десорбцией с катионита щелочными растворами, полученный элюат обесцвечивают активированным углем вконцентрации 1,0 - 1,5 фпри перемешива 35 нии,2, Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что фермент десорбируют с катионитав статических условиях при рН 8,5-8,8,3. Способ по п.1, отл и ча ю щи йс я40 тем, что фермент десорбируют промыванием катионита в колонке 0,2 М МагНРО 4.Таблица 11723121 10 Табли ца 5 Стадии Пример Ю Очистки тДесорбция,рИ Обесцвечиваниеуглем,В Сорбции рй скорост ь мл/ч см В статике 30 70 8,7 З 5 1,0 70 1,2 100 8,8 1,5 50 1,2 9,0 70 В динамике 4,5 5,0-10,0 1,2(2 оаммиака) 70 30 5,0-0 1,2 70 0,2 Мр-рМаОН) 10 5,5-7,5 1,20,2 Ир-Р11 а ПРО 4 70 70 45 50 Составитель Т.УваркинаТехред М,Моргентал Корректор В.Гирняк Редактор Н,Горват Заказ 1042 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 4,4 4,5 5 4,4 Ь 4,Ь 7 4,4 Выходгиалуронидазы, 4 Удельнаяактивност ьИЕ/мгбелка 48 60 52 25
СмотретьЗаявка
4784556, 19.01.1990
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОТЕХНОЛОГИИ
УВАРКИНА ТАМАРА ПАВЛОВНА, МОЛОДОВА ГАЛИНА АЛЕКСЕЕВНА, МАКСИМОВ ВЯЧЕСЛАВ ИВАНОВИЧ, МАТЮШИНА ТАТЬЯНА АНДРЕЕВНА, ДАНИЛОВА ТАТЬЯНА АНДРЕЕВНА, ШАТАЕВА ЛАРИСА КОНСТАНТИНОВНА, ЖУКОВА НЕЛЛИ ГАРИФОВНА, ЗОРИНА АРИАДНА ИВАНОВНА, ОЖЕРЕЛЬЕВ СЕРГЕЙ ЮРЬЕВИЧ
МПК / Метки
МПК: C12N 9/14
Метки: гиалуронидазы
Опубликовано: 30.03.1992
Код ссылки
<a href="https://patents.su/5-1723121-sposob-polucheniya-gialuronidazy.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения гиалуронидазы</a>
Предыдущий патент: Штамм вируса гриппа а(h10n1) для приготовления диагностических препаратов
Следующий патент: Способ получения гиалуронидазы
Случайный патент: Поточно-механизированная линия сшивки поддонов