Способ получения гиалуронидазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ 1723121 А ЕСПУБЛИ 5)5 С 12 И(57)гии,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) Авторское свидетельство СССРМ 974816, кл. С 12 М 9/14, 1980. Б ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИД Изобретение относится к биотехнолов частности к микробиологической проИзобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической промышленности, и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов для приготовления лекарственных средств,Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ, в котором продуцент гиалуронидазы - штамм Ятгерсоаусез асбпосЫцз 77 - выращивали глубинным способом, культуральную жидкость концентрировали вакуум-выпариванием при 40- 60 С и рН 7,5 - 8,5, фермент выделяли осаждением из культуральной жидкости 3 - 4 объемами этилового спирта. В результате получали препарат гиалуронидазы с активностьюю 450 - 800 М Е/г (колоримерический метод) и удельной активностью 7 - 10 МЕ/мг белка. мышленности, и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов для приготовленИя лекарственных средств, Цель изобретения - повышение активности и степени чистоты гиалуронидазы. Способ заключается в том, что штамм Я 1 герюгпусез асбпосЫоз 77 выращивают глубинным способом, фильтрат культуральной жидкости подкисляют до рН 4,4 - 4,6, осветляют и сорбируют на карбоксильном катионите КМп. Сорбент промывают и гиалуронидазу десорбируют щелочными растворами, затем элюат обесцвечивают активированным углем при перемешивании и уголь отделяют. Удельная активность продукта 60 МЕ/мг, степень очистки 30. 2 з, и. ф-л ы, 5 табл. Недостатками данного технического решения являются низкая активность и степень чистоты гиалуронидазы. юйЦель изобретения - повышение активности и степени чистоты гиалуронидазы.Штамм Ясгертогпусез асбпосдоз 77 выращивают глубинным способом на питательевеЬ ной среде определенного состава, фильтрат культуральной жидкости подкисляют 2 И соляной кислотой до рН 4,4 - 4,6, осветляют ф центрифугированием или фильтрацией исорбируют на карбоксильном катионите КМп (40 - 60 объемов на объем сорбента) со скоростью 50 - 100 мл/ч/см, сорбент2промывают 0,01 М ацетатным буфером рН 4,4 - 4,6, гиалуронидазу десорбируют щелочными растворами, затем элюат обесцвечивают активированным углем в концентрации 1,0 - 1,5% при перемешивании и уголь отделяют, Десорбцию можно прово 1723121дить либо в статических условиях при рН 8,5 - 8,7, либо в динамике растворами щелочи, аммиака или раствором фосфорнокислого натрия двузамещенного.В табл, 1 представлены данные по подбору условий сорбции гиалуронидазы из 1 л фильтрата культуральной жидкости на колонке с карбоксильным катионитом КМп объемом 20 мл (Ф = 1,1 см,= 5 см). Для сравнения приведены данные по сорбции гиалуронидазы на колонке тех же размеров с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) и некоторых других карбоксильных катионитах.Из табл, 1 следует, что из пяти испытанных карбоксильных катионитов только КМ 2 п практически полностью сорбировал гиалуронидазу. Сорбцию фильтрата культу- ральной жидкости на катионите необходимо проводить в интервале рН 4;4 - 4,6, при этом на стадии подкисления гиалуронидазная активность сохраняется на 60 - 70 ,при снижении рН до 4,2 гиалуронидаза инактивируется сильнее и активность сохраняется лишь на 50 . При увеличении рН до 4,8 количество фермента в "проскоке" достигает 15 , что уменьшает выход фермента,Важное значение имеет скорость сорбции фильтрата культуральной жидкости на катионите. Оптимальным является интервал 50 - 100 мл/ч/см, При уменьшении скогрости ферментный раствор при кислых значениях рН (4,5) длительное время сорбируется на колонку, что приводит к снижению стабильности гиалуронидазы, В результате увеличения скорости сорбции пропорционально повышается выход фермента в "проскоке" и соответственно снижается количество гиалуронидазы в элюате.Гиалуронидазу десорбируют различными щелочными растворами в статических условиях в воду путем сдвига рН или в динамических условиях путем пропускания различных элюентов через колонку с сорбентом,Данные по подбору условий десорбции приведены в табл. 2 (сорбцию фермента проводили в оптимальных условиях; рН 4,5, скорость 70 мл/ч/см ).Из табл. 2 следует, что десорбцию гиалуронидазы в статических условиях необходимо проводить при рН выше 8,5, при этом выход на стадии составлял 55-60 . Увеличение рН выше 8,8 приводило к элюции большого количества балластных белков, что вызывало уменьшение удельной активности в конечных препаратах (см. табл. 5),В табл. 3 приведены экспериментальные данные по подбору условий обесцвечивания растворов гиалуронидазы активированным углем, 5 10 15 Результаты опытов свидетельствуют о том, что при концентрации угля 1,0 - 1,5 происходит обесцвечивание раствора гиалуронидазы на 75 - 78 при сохранении активности на стадии до 85-90 , При снижении концентрации угля в растворе остается значительное количество пигментов, что отрицательно влияет на качество препаратов, Увеличение концентрации угля до 2,0 приводит к снижению выхода гиалуронидазы на стадии обесцвечивания,Схема получения гиалуронидазы попредлагаемому способу представлена втабл. 4.Как видно из табл. 4, предлагаемаясхема позволяет получить гиалуронидазу высокой степени очистки с удельной активностью 60 МЕ/мг белка и общим выходомфермента 35 ,20 П р и м е р (по прототипу), Продуцентгиалуронидазы Ятгертотусез асбпосЫоз 77выращивали в ферментере емкостью 250 л(заполнение 180 л) на среде, содержащей3/ гидролизата БВК, 0,8 сульфата аммо 25 ния. 0,1 К 2 Н Р 04. Аэрация в процессе культивирования дробная: первые 12 ч роста - 9м /ч, затем до конца культивирования 27м /ч, рН в начале культивирования 6,8,время выращивания 56 ч, По окончании30 выращивания мицелий отделяют центрифугированием, фильтрат культуральной жидкости (150 л) упаривали в 10 раз. Кконцентрату добавляли 4 объема охлажденного этилового спирта, осадок отделяли на35 нутч-фильтре и лиофилизировали. Получалипрепарат гиалуронидазы с активностью 450МЕ/г и удельной активностью 8 МЕ/мг белка,П р и м е р 1. Продуцент гиалуронидазы40 выращивали на той же питательной среде, втеж же условиях, что и в примере по прототипу, мицелий отделяли центрифугированием, Получали 150 л фильтрата культуральнойжидкости с активностью 13 МЕ/мл и удель 45 ной активностью 2,0 МЕ/мг белка, Фильтрат подкисляли 2 й соляной кислотой до рН4,5 и сорбировали на колонку (б = 12 см, 1=28 см) с 3,0 л карбоксильного катионита КМ 2 п кислотного гидролиза (биокарб К), урав 50 новешенного 0,01 М ацетатным буфером рН4,5, Скорость сорбции - 70 мл/ч/см, времягсорбции 19 ч. Катионит после сорбции переносили в емкость с мешалкой, дважды (по 3л) отмывали 0,01 М ацетатным буфером рН55 4,5, Гиалуронидазу десорбировали с катионита в статических условиях 7,5 л дистиллированной воды путем доведения рН дозначения 8,7 раствором 2 М едкого натрия,Перемешивали смесь 15 мин, элюат отфильтровывали через капроновую ткань, затем1723121выход фермента составляет 31-35 ф , а удельная активность достигается 49 - 60 МЕ/мг белка (примеры 4 - 6). Увеличение рН при десорбции больше 9,0 приводит к зна 5 чительному снижению удельной активностив препарате. Наилучшие результаты по десорбции гиалуронидазы в динамике получены при использовании 0,2 М раствора форсфорнокислого натрия двузамещенно 10 го, при этом удельная активность достигает70 МЕ/мг белка(пример 10). Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать фермент с высокой степенью очистки. По сравнению с примером-прототипом удель 15 ная активность гиалуронидазы выше в 7 - 9раз (примеры 4, 10).Формула изобретения1. Способ получения гиалуронидазы.20 предусматривающий глубинное выращивание продуцента Зтгертовусез асбпосбцз77, отделение мицелия, выделение фермента из полученной культуральной жидкости иочистку,отличающийся тем,что,с25 целью повышения активности и степени чистоты гиалуронидазы, культуральную жидкость подкисляют до рН 4,4-4,6, а очисткуфермента ведут сорбцией через колонку скарбоксильным катионитом КМп кислот 30 ного гиуролиза со скоростью 50 - 100мл/ч/см и десорбцией с катионита щелочными растворами, полученный элюат обесцвечивают активированным углем вконцентрации 1,0 - 1,5 фпри перемешива 35 нии,2, Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что фермент десорбируют с катионитав статических условиях при рН 8,5-8,8,3. Способ по п.1, отл и ча ю щи йс я40 тем, что фермент десорбируют промыванием катионита в колонке 0,2 М МагНРО 4.Таблица 11723121 10 Табли ца 5 Стадии Пример Ю Очистки тДесорбция,рИ Обесцвечиваниеуглем,В Сорбции рй скорост ь мл/ч см В статике 30 70 8,7 З 5 1,0 70 1,2 100 8,8 1,5 50 1,2 9,0 70 В динамике 4,5 5,0-10,0 1,2(2 оаммиака) 70 30 5,0-0 1,2 70 0,2 Мр-рМаОН) 10 5,5-7,5 1,20,2 Ир-Р11 а ПРО 4 70 70 45 50 Составитель Т.УваркинаТехред М,Моргентал Корректор В.Гирняк Редактор Н,Горват Заказ 1042 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 4,4 4,5 5 4,4 Ь 4,Ь 7 4,4 Выходгиалуронидазы, 4 Удельнаяактивност ьИЕ/мгбелка 48 60 52 25