Способ получения гиалуронидазы

, С 12 й 9/26,27 0.1990 ДА эводствуяемых вспособуьзуемойГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБР ОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) АвторскоеМ 566875, кл.АвторскоеЬЬ 1666534, кл юл. %12й научно-исследовательский тильно-галантерейной про(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРЗЫ(57) Изобретение относится к проиферментных препаратов, применмедицинской практике,а именно кполучения гиалуронидазы, испол Изобретение относится к производству ферментных препаратов, применяемых в медицинской практике, а именно к способу получения гиалуронидазы, используемой для приготовления препаратов "Ронидаза" и "Лидаза", оказывающих положительное действие при лечении контрактур и тугоподвижности суставов, рубцов, длительно неза- живающих ран и яэв.Цель изобретения - повышение выхода и активности фермента, а также сокращение времени его получения. Способ осуществляют следующим образом.Измельченные семенники крупного рогатого скота. заливают водным раствором для приготовления препаратов "Ронидаза" и "Лидаза", оказывающих положительное действие при лечении контрактур и.тугоподвижности суставов, рубцов, длительно незаживающих ран и язв. Цель изобретения - повышение выхода и активности фермента, а также сокращение времени его получения, Изобретение заключаетея в том, что проводят экстракцию измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7, температуре 60 - 70 С в течение 30-40 мин и,в при.сутствии поливинилхлорида и лактата кальция при их соотношении соответственно 20-40 г и 1 - 2 г на 1 кг сырья с последующей очисткой осаждением гиалуронидазы из экстракта водным раствором гидроокиси Б натрия при рН 6,2 - 6,8 и переосаждением этиловым спиртом и сушкой фермента, 1 табл. уксусной кислоты при рН 4,5-4,7, дсбавляют поливинилхлорид из расчета 20-40 г на 1 кг сырья и лактат кальция из расчета 1 - 2 г на 1 кг, Экстракцию проводят при 60-7030-40 мин при постоянном перемешивании, Жмых отделяют сепарированием, в экстракте после охлаждения осаждают гиалуронидазу водным раствором гидроокиси натрия при рН 6,2 - 6,8 с последующим переосаждением этиловым спиртом и досушиванием на воздухе.Поливинилхлорид получают суспензионной или эмульсионной полимериэацией винилхлорида, молекулярная масса около 150000, плотность 1,35-1,43 г/см, т,пл.150 в 20, не растворим в воде и спиртах,растворим в циклогексане и тетрагидрофуране.В ы ход целевого и роду кта 10 - 12 0 от массы сырья, а его активность 2048-4096 ед/100 мг.П р и м е р 1. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты (жидкостной коэффициент 1:1), 2 кг поливинилхлорида (20 г/кг сырья) и 0,1 кг лактата кальция (1 г/кг сырья), устанавливают рН 4,5 и проводят экстракцию при 60 С и постоянном перемешивании ЗО мин, Жмых отделяют сепарированием, а к 115 л экстракта осторожно добавляют после охлаждения до 20 С 0,1 н. раствор ИаОН до рН 6,2, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 3 л воды, раствор фильтруют и фильтрат вливают в 12 л (4 объема) охлажденного до 4 С этилового спирта, образовавшийся осадок отделяют, промывают многократно спиртом и досушивают на воздухе, Получают 10 кг порошка гиалуронидазы (выход 10% от массы сырья) с величиной гиалуронидазной активности 2048 ед/100 мг,П р и м е р 2. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 150 л 0,1 н, водного раствора уксусной кислоты (жидкостной коэффициент 1:1,5), 3 кг поливинилхлорида (30 г/кг сырья) и 0,15 кг лактата кальция (1,5 г/кг сырья), устанавливают рН 4,6 и проводят экстракцию при 65 С и постоянном перемешивании 37 мин, жмых отделяют сепарированием, а к 145 л экстракта осторожно добавляют после охлаждения до 22 С 0,1 н. раствор йаОН до рН 6,4, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 4 л воды, раствор фильтруют и фильтрат вливают в 16 л (4 объема) охлажденного до 5 С этилового спирта, образовавшийся осадок отделяют многократно промывают спиртом и досушивают на воздухе, Получают 11 кг (выход 11% от массы сырья) порошка гиалуронидазы с величиной гиалуронидазой активности 4096 ед/100 мг.П р и м е р 3. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 200 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты (жидкостной коэффициент 1:2), 4 кг поливинилхлорида (40 г/кг сырья) и 0,2 кг лактата кальция (2 г/кг сырья), устанавливают рН 4,7 и проводят экстракцию при 70 С и постоянном перемешивании 40 мин, жмых отделяют сепарированием, а к 175 л экстракта осторожно добавляют после охлаждения до 25 С 0,1 н, раствор МаОН до рН 6,8, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 5 л воды, раствор фильтруют ифильтрат вливают в 20 л (4 объема) охлажденного до 6 С этилового спирта, осадок5 отделяют, многократно промывают спиртоми досушивают на воздухе, Получают 12 кг(выход 12% от массы сырья) порошка гиалуронидазы с величиной гиалуронидазной активности 4096 ед/мг.10 П р и м е р 4. 100 кг семенников крупногорогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н, водного растворауксусной кислоты и далее поступают как впримере 1, за исключением того, что экстра 15 кцию проводят 30 мин при 50 С, Получают8 кг порошка гиалуронидазы (выход 8 фотмассы сырья) с активностью 2040 ед/100 мг.П р и м е р 5, 100 кг семенников крупногорогатого скота измельчают дважды на волч 20 ке, добавляют 100 л 0,1 н. водного растворауксусной кислоты и далее поступают, как впримере 1, за исключением того, что экстракцию проводят 30 мин при 80 С, Получают10 кг порошка гиалуронидазы (выход 10% от25 массы сырья) с активностью 512 ед/100 мг,П р и м е р 6, 100 кг семенников крупногорогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н, водного растворауксусной кислоты, 1 кг поливинилхлоридаЗО (10 г/кг сырья) и 0,05 кг лактата кальция (0,5г/кг сырья) и далее поступают как в примере1, Получают 8 кг порошка гиалуронидазы сактивностью 64 ед/100 мг,П р и м е р 7, 100 кг семенников крупного35 рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного растворауксусной кислоты и 2 кг поливинилхлоридаи далее поступают как в примере 1. Получают 10 кг порошка гиалуронидазы (выход40 10% от массы сырья) с активностью 256ед/100 мг,П р и м е р 8, 100 кг семенников крупногорогатого скота измельчают дважды на волч ке, добавляют 100 л 0,1 н. водного растворауксусной кислоты и 0,1 кг лактата кальция (1 г/кг сырья) и далее поступают как в примере 1, Уже через 10 мин после начала эКстракции образуется резиноподобный осадок, 50 почти не растворимый в воде, не обладающий гиалуронидазной активностью.П р и м е р 9. 100 кг семенников крупногорогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора 55 уксусной кислоты и далее поступают как впримере 1, за исключением того, что в экстракте после отделения жмыха устанавливают рН 5,8. Получают 4 кг порошка (4% от массы сырья) с величиной гиалуронидазной активности 64 ед/100 мг.1723122 Формула изобретенияВеличину гиалуронидазной активности определяли по методу предупреж образования муцинового сгустка, описанному в ВФС 42-182 - 72 на "Ли 25 Составитель Е.Воробьева едактор Н,Горват Техред М,Моргентал Корректор Э.ЛончаковаЗаказ 1042 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 10 П р и м е р 10. 100 кг семенников крупного рогатого скота измельчают дважды наволчке, добавляют 100 л 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты и далее поступаюткак в примере 1, за исключением того, что в 5экстракте устанавливают рН 7,2. Получают5 кг порошка (выход 5 оот массы сырья) свеличиной гиалуронидазной активности 64ед/100 мг.В таблице приведен сопоставительный 10анализ технико-экономических показателей предлагаемого и известного способа,Из таблицы видно, что процесс получения гиалуронидазы по предложенному способу занимает меньше времени (на 6-10 ч) 15по сравнению с известным. При этом увеличивается выход целевого продукта (на 2 Зо ) и его гиалуронидазная активность(примерно в 2 раза),20 Способ получения гиалуронидазы, предусматривающий экстракцию фермента из измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5 - 4,7, последующую очистку и сушку, отличающийся тем,что,сцелью повышения выхода и активности фермента, а также сокращения времени его получения, экстракцию проводят при 60-70 С в течение 30 - 40 мин в присутствии поливинилхлорида и лактата кальция, которые вносят в количестве соответственно 20-40 г и 1 - 2 г на 1 кг сырья., а очистку проводят путем осаждения гиалуронидазы из экстракта водным раствором гидроокиси натрия при рН 6,2 - 6,8 и переосаждения этиловым спиртом,