Штамм вируса гриппа а(h10n1) для приготовления диагностических препаратов

(я)5 С 12 й ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ гии, логи тов,К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт микробиологии и вирусологии АН КазССР(56) Эпидемиология - В кн. Вирусы гриппа и грипп /Под ред, Э.Д.Кильбурна. М 1978. - 1,526-580.Магрибу ВЯ., Вассег - В/Ьте А,1опбоп И.Т. ес а, Ачап-Ьшпап геаззопапс п Лоепа А игцзез бегнес Ьу арпап 9 ачап апб 3 сиспап пйиепга А чгизез, - ,3, поест, Оз, - 1984. - но. 150, М 6, - р, 841 - 850.(54) ШТАММ ВИРУСА ГРДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к вирусологии, в частности к производству вирусологических диагностических препаратов. Цель изобретения - используя метод рекомбинации; получить новый вариант штамма-рекомбинанта вируса гриппа Н 1081, обладающего специфической иммуногенной активностью, позволяющей использовать его для приготовления диагностических препаратов при идентификации вновь выделяемых вирусов гриппа. Штамм (Ш) вируса гриппа А(С 10 И 1) предобретение относится к вирусолоастности к производству вирусоских диагностических препараЫ 1723120 А 1 ставляет собой селекционированный рекомбинант вирусов гриппа человека и птиц с новой антигенной формулой. Ш агглютинирует эритроциты кур в титрах 1:640, активно репродуцируется при оптимальной (37 С), повышенной (40 С) температурах в течение 48 ч до инфекционного титра 8,5 - 8,75 д ЭИ 05 о/0,2 мл. Полученный рекомбинант репродуцируется в клетках МДСК до 9 4,0 ТЦД 5 о, в клетках Чего 4647 до д 3,0 ТЦД 5 о, в клетках ВНКдо 92,0 ТЦД 5 о и первичных клетках ФЭЧ до 9 2,0 ТЦД 5 о. Проявляет слабо выраженную патогенность (2,0 9 .05 о) в сравнении со штаммом А/РВ/8/34 (Н 1 ч 1), вызывающим гибель мышей в дозе 4,0 9О 5 о. НА рекомбинантного Ш Кболее устойчив к прогреванию, чем НА реципиентного родительского штамма, Ш по сравнению с родительскими вирусами проявляет высокую интерферонпродуцирующую активность в органных культурах легких человека. Имеет следующий генный состав: гены МР, МАМ, МЯ - от штамма А/РВ/8/34; гены РВ 1, РВ 2, РА, НА - от штамма А (травник) Алма-Ата /760/79, Штамм депонирован под номером ГКВ М 2235. Рекомбинант может быть использован для производства диагностических препаратов, предназначенных для индикации вновь изолированных вирусов гриппа и обнаружения антител в сыворотках различного видового происхождения. 2 табл. Возможность зкспериментального получения антигенных рекомбинантов, обладающих гемагглютинином одного вируса и нейраминидазой другого, продемонстрирована рядом исследователей, Большое количество подобных штаммов в последние годы изолировано от диких и домашних птиц и в естественных условиях в результате широко развернутого экологического изучения диких птиц в различных странах. Однако отсутствуют сведения о получении штаммарекомбинанта вируса гриппа человека и птиц с сочетанием поверхностных антигенов Н 10 И 1.Цель изобретения - используя метод рекомбинации, - получить новый вариант штамма-рекомбинанта вируса гриппа Н 10 К 1, обладающего специфической иммуногенной активностью, позволяющей использовать его для приготовления диагностических препаратов при идентификации вновь выделяемых вирусов гриппа.Штамм получен в опытах рекомбинации между вирусом гриппа человека А/РВ/8/34 (Н 1 К 1) и вирусом гриппа птиц А/Травник/Алма-Ата/760/79 (Н 10 М 5). Направленная селекция проводилась в системе куриных эмбрионов в присутствии гипериммунной сыворотки к рекомбинантному штамму Н 1 К 5, После 5 последовательных пассажей в присутствии сыворотки выделен рекомбинант, обозначенный Вс антигенной формулой Н 10 М 1, Полученный рекомбинант трижды клонирован методом предельных разведений и был генетически стабилен. Антигенная характеристика и результаты изучения генетических признаков у родительских вирусов и рекомбинантов представлены в табл, 1 и 2,Из таблицы следует, что рекомбинант обладал гемагглютинином птичьего вируса - Н 10 и нейраминидазой М 1 человеческого штамма,Представленный штамм депонирован под номером ГКВ В 2235 и имеет следующие молекулярно-биологические свойства,Адаптационные свойства, Полученный рекомбинант активно репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (36 С), повышенной (40 С) температурах до инфекционного титра 8,25 - 8,75 1 д ЭИД 5 о/0,2 мл и менее активно при пониженной (28 С) температуре инкубации, Рекомбинант обладает высокой гемагглютинирующей (титр 1/512 - 1/1024) и иммуногенной активностью,Полученный рекомбинант репродуцируется в клетках МДСК до 4,0 1 д ТЦД 5 о, в клетках Чего - 4647 до 3,019 ТЦД 5 о, в клетках ВНКдо 2,01 д ТЦД 5 о и в первичных клетках ФЭЧ до 2,01 д ТЦД 5 о.У рекомбинанта Встепень репродукции в органных культурах почек эмбриона человека на 1 - 21 д была выше способности к репродукции обоих родителей (А/РВ/8/34, А/Травник/Алма-Ата/760/79).Терморезистентность (Ты - признак),Селекционированный рекомбинант обладает так же, как и один из родительских штаммов А/РВ/8/34 (Н 1 М 1), терморезистентным гемагглютинином (Ты - 2 ч). Однако гемагглютинин вируса-рекомбинанта был болееустойчив к прогреванию, чем гемагглюти 10 нин другого родительского штамма А/травник/Алма-Ата/760/79,Патогенные свойства. Исследуемыйштамм-рекомбинант проявляет слабо выраженную патогенность (2,01 д 105 о) для15 белых мышей по сравнению со штаммомА/РВ/8/34 (Н 1 М 1), вызывающим гибель животных в дозе 4,019 Ю 5 о.Молекулярно-биологический анализ.Анализ генов предлагаемого штамма пока 20 зал, что рекомбинант Вприобрел от родительского штамма А/РВ/8/34 4 гена (МР,МА, М и МЗ), остальные 4 гена (РВ 1, РВ 2, РА,НА) - от другого родителя А/травник/АлмаАта/760/79,25 П р и м е р, Диагностическую иммуннуюсыворотку получают на кроликах породышиншилла или на белых крысах. В качествеантигена для иммунизации используютэлюат вируса из формалинизированных30 эритроцитов кур, Титр гемагглютининов составляют 1/1024.,Схема иммунизации, Кролику непосредственно в оба подколенных лимфатических узла вводят 0,1 мл антигена с35 адьювантом. Через месяц повторно инъецируют антиген в том же количестве, но безадьюванта. Антиген разводят в большом количестве физиологического раствора и вводят кроликам внутривенно (0,2 мл),40 внутримышеч: о (передняя лапа; 0,4 мл) и вобласть одного из подколенных лимфатических узлов (0,4 мл). Кровь у кроликов берутиз краевой вены уха через 10 - 14 дней послеиммунизации.45Специфичность и активность антисывороток определяют в РТГА, Полученные сыворотки имеют титр антигемагглютинирующих антител 1:5120 и выше,50Иммунную сыворотку освобождают отнеспецифических ингибиторов обработкой отечественным препаратом нейраминидазы из нехолерного вибриона (ВОЕ).55Предлагаемый штамм-рекомбинант вируса гриппа А(Н 10 М 1)-Ви изготовленныйна его основе диагностический препарат может найти применение в вирусологической практике для идентификации вновь1723120 выделенных щтаммов и изучения иммунологической структуры населения, домашних идиких животных. Таблица Изучение антигенного состава родительских штаммов и рекомбинантагсС37 Идно 10 тиген мШтаммы бинант 40 воиств 8,0 5 64/травник/А-Ата/760/79 5 8,75 8,75 10 М 5 0 4,5 Н 10 М 35 Составитель Р.ПодчерняеваяТехред М,Моргентал Коррек Редакт Кунд орват аказ 1042 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 та/760/79 Н 1 М 1) 0 0 0 Антигенные и биологическиеи рекомбинантоНАа Формула изобретения Штамм вируса гриппа А(Н 10 И 1), ГКВ 1 Ф2235, для приготовления диагностическихпрепаратов,