Способ получения конъюгатов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТ ИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН АЗ(19 (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Он(СВ) (П 8), обин Н- СН 2 СН СОСН СН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Лилли Индастриз Лимитед(72) Джордж Джозеф КаллинанДжордж Фердинанд Роулэнд и РДжордж Симмондс (СВ)(56) ОпдеСеп М., .7 оЬп У 1 еу апй ВоРерСЫе ЯупйЬезз, 1976, р. 85-136Патент Великобритании У 2090837кл С 07 С 7/00, опублик. 1982. 511 4С 07 В 519/04 С 07 К 17/02(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ иммуноглобулина или нммуноглобулинового фрагмента, содержащих от 5,8 до 14,3 винковых остатков общей формулы где 18 - иммуноглобулин или иммуноглобулиновый фрагмент;К, - СООСН или СОБНК 2 - Снз или Сноэо т л и ч а ю щ и й с я тем, что иммуноглобулин или нммуноглобулиновый фрагмент подвергают взаимодействию в водной среде при рН 8,6 с винковым алкалоидом общей формулы (1), где 18 замещен сложноэфирной И-гидроксисукцинимидогруппой, полученной взаимодействием 4-сукциноилвинкового алкалоида общей формулы (Т), где 18 замещен на ОН-группу, И-гидрокси-, сукцинимида и 1-циклогексил-(2- -морфолиноэтил)-карбодиимидо-мето-и-толуол сульфоната.1 13Изобретение относится к новым иммуноглобулиновым (парным соединениям) конъюгатам с фармацевтическими свойствами, в особенности с цитостатическим действием.Предлагаемые парные соединенияконъюгаты можно представить следующей формулой:5 о 1 62404 2тина, применяя глутаровый ангидридвместо ангидрида янтарной кислоты.Любое случайное ацилирование 3-ОН-группы можно реверсировать путем обработки на влажном силикагеле в соответствии с процедурой. По другому варианту соединения можно очистить отлюбых 3-ацилпроизводных или другихпобочных продуктов реакции путем хроматографии обычно на силикагеле, используя в качестве раствора для элюирования смесь растворителя этилаце-СН ОСОСИСИхС 09ОН где 1 р - иммуноглоб глобулинов СООСН или К - СН или СН а Э Цель изобретения конъюгатов иммуногл фрагментов, обладаю и. селективным проти ствием по сравнениюулин или иммуной фрагмент; СОМН нов инте булинаих бол и его сильным вым дейвыми осопух инк нованиями.Способ получения 4-сукциноилдезацетилвинбластина,2 г 4-дезацетилвинбластина растворяют в пиридине, к раствору которогодобавляют 2 г ангидрида янтарной кислоты. Реакционную смесь перемешиваютпри температуре окружающей среды втечение 5 ч (для этой реакции можноиспользовать температуры в интервале0-50 С). Летучие составляющие удаляют путем выпаривания в вакууме и остаток вводят в СН С 1. Слой СН С 1промывают 5%-ным водйыМ раствором бикарбоната натрия, а затем водой. Органический слой высушивают и растворитель из него удаляют в вакууме,что дает 4-сукциноилдезацетилви скролика.К раствору 4-сукциноилвандезина(25 мг) в сухом диметиформамиде (ДМФА) (0,4 мл) добавляют при перемешивании 0,3 мл 11,4.мг/мл раствора И-гидроксисукцинимида в сухом ДМФА и далее 0,3 мл 41,7 мг/мл раствора1-циклогексил-(2-морфолиноэтил)- -карбодиимид-мето-р-толуолсульфоната в сухом ДМФА. Смесь выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 48 ч и получают 0,25 мг/мл раствора 4-сукциноилвиндезин-Б-гидроксисукцинимидового сложного эфира. ,5090 мл упомянутого раствора добавляют при быстром перемешивании к 0,9 мл 10,7 мг/мл раствора кроличьего противомышинового ИгС в 0,34 М бо 55 ратном буфере с рН 8,6. Смесь перемешивают при комнатной температуре втечение 5,5 ч, продукт вьщеляют с помощью гель-фильтрации на колонке 1 27 см (21 мл) Био-Гель Р, уравно нбла тин. ру используютоилвиндезина,нкристина, 4 езацетилвинспользуют длязацетилвинбласПриведенную процед для получения 4-сукци 4-сукциноилдезацетилв"сукциноил-эпидексид бластина. Подобную процедуру получения 4-глютароилдтат/этанол.Способ получения активированного4-сукциноилдезацетилвинбластина.1 г 4-сукциноилвиндезина смешивают с.380 мг И-метилморфолина в 20 млметиленхлорида и добавляют 390 мг 0 изобутиллоформата, Реакционную смесьперемешивают при температуре приблиозительно 0 С в атмосфере азота в течение приблизительно 45 мин. Добавляют 795 мг И-гидроксисукцинимида и 25 реакционную смесь нагревают до температуры кипения раствора в атмосфереМ с перемешиванием в течение приб 2лизительно 45 мин. Реакционную смесьохлаждают. Охлажденную смесь промыЗ 0 вают деионизированной водой и сразуже высушивают над На 80 . Осушающийагент отделяют фильтрацией и фильтратвыпаривают до сухого состояния в вакууме.П р иЗ 5 ловый кон м е р 1. Виндезинсукцинои ъюгат противомьппинного ИгС3 13624 вешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера, Собирают исключенный пик (4,9 мл), Проверяют на содержание белка и виндеэина с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм. Конъюгат,5 приготовленный таким образом, содержит 7,9 моль виндезина на моль Иг,П р и м е р 2, Виндезинсукциноилмоноклональный конъюгат антиостеоген ной карциномы кролика.300 мл 28 мг/мл раствора сложного 4-сукциноилвиндезин-И-гидроксисукцинимидового эфира в сухом ДМФА, приготовленного аналогично способу, описанному в примере 1, добавляют при быстром перемешивании к 4,5 мл 19,8 мг/мл раствора моноклональной антиостеогенной саркомы мыши в 0,34 М боратном буфере с рН 8,6. Смесь пере О мешивают при комнатной температуре в течение 4 ч, затем очищают с помощью центрифугирования и продукт выделяют с помощью гель-фильтрации всплывшей части на колонке 1,5 26,5 см (46,8 мл) 25 Био-Гель Р, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (5,52 мл). Определяют на наличие виндезина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм. Конъюгат, приготовленный таким образом, содержит 8,7 моль виндезина на моль Иг.П р и м е р 3. Виндезинсукциноиловый конъюгат моноклонального анти 35меланомного антигена мьпии.200 мл 20 мг/мл раствора 4-сукциноилвиндезинового сложного И-гидроксисукцинимидового эфира в сухом ДМФАприготовленного аналогично способу,описанному в примере 1, добавляютпри быстром перемешивании к 1,0 мл21,2 мг/мл раствору моноклональногоантималеномного антигена мыши в0,34 М боратном буфере с рН 8,6.45Смесь перемешивают при комнатной.температуре в течение 4 ч и продукт выделяют с помощью гель-фильтрации наколонке 1,5 26 см (45,9 мл) Био-ГельР, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исклю 50 ченный пик собирают (12,31 мл) и анализируют на содержание виндезина и белка на 270 и 280 нм. Конъюгат, приготовленный таким образом, содержит 9,1 моль виндезина на моль Иг.55 1П р и м е р 4. Виндеэинсукциноиловый конъюгат моноклонального антикарциноэмбрионного антигена мыши. 04 41,0 мл 22 мг/мл раствора 4-сукциноилвиндеэинового сложного М-гидроксисукцинимидового эфира в сухом ДМФА, приготовленного по способу, аналогичному по примеру 1, добавляют с быстрым перемешиванием к 7,0 мл 21,4 мг/мл раствора моноклонального антикарциноимбриогенного антигена мыши в 0,34 М боратном буфере с рН 8,6. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч, затем разбавляют 3,5 мл 0,7 М хлорид натрия в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,4, и продукт выделяют с помощью гель-фильтрации на 3, 2 24, 4 см (196 мл) на колонке Био-Гель Р, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (28,24 мл) и анализируют на содержание виндезина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 им; Конъюгат, полученный таким образом, содержит 5, 8 моль виндезина на моль Иг.П р и м е р 5. Дезацетилвинбластинсукционоиловый конъюгат кролика антимьппиного Иг.К раствору 4-сукциноилдезацетилвинбластина (18 мг) в сухом ДМФА (0,4 мл) добавляют при перемешивании 0,3 мл 7,97 мг/мл раствора И-гидроксисукцинимида в ДМФА и далее 0,3 мл 14,4 мг/мл раствора 1,3-дициклогексикарбодиимида в сухом ДМФА. Смесь держат при комнатной температуре в темноте в течение 19 ч, получив 18 мг/мл раствора сложного 4-сукциноилдезаце- тилвинбластин-И-гидроксисукцинимидового эфира.Добавляют 200 мл упомянутого раствора при быстром встряхивании к 1,8 мл 8,02 мг/мл раствора кроличьего анти- мышиного Иг в 0,34 М боратном буфере с рН 8,6. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 ч, затем очищают центрифугированием, и продукт выделяют иэ всплывшей части с помощью гель-фильтрации на 1,5 2,5 см (44 мл) колонке БиоГель Р, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (647 мл) и анализируют на содержание дезацетилвинбластина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм. Конь-, югат, полученный таким образом, содержит 9,0 моль дезацетилвинбластина на моль Иг.(0,1 мл) добавляют при перемешивании0,2 мл 6,5 мг/мл раствора И-гидроксисукцинимида в сухом ДМФА и далее 100,2 М 24,0 мг/мл раствора 1-циклогексил-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-мето-р-толуолсульфоната в сухом ДМФА.Смесь выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 65 ч, 15что дало 20 мг/мл раствора сложного4-сукциноилдезацетилвинкристин-И-гидроксисукцинимидового эфира.200 мл упомянутого раствора добав 1ляют при быстром перемешивании к1,0 мл 22,7 мг/мл раствора монокло 2нального антимеланомного антигенамыши в 0,34 М боратном буфере с рН8,6, Смесь перемешивают при комнатнои температуре в течение 4 ч и про4дукт выделяют с помощью гель-фильтрации на 3,2 24,5 см (197 мл) колонке5Био-Гель Р, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. ИСключенный пик собирают 30(14,16 мл) и анализируют на содержание белка и дезацетилвинкристина спомощью спектроскопии на 270 и 280 нм,Конъюгат, полученный таким образом,содержит 14 3 моль дезацетилвинкрис 935тина на моль Иг.П р и м е р 7. Дезацетилвинбластинсукциноиловый конъюгат антиаденокарциномы легких мыши. Таблица 1-поглощениеческая плотсть) рация мг/мл по пр меру 6.270 о,с 1 80 2,80 20,236 0,256,0, 541 26 6 13624П р и м е р 6, Дезацетилвинкристинсукционоиловый конъюгат моноклонального антимеланомного антигена 350 мл 14,7 мг/мл раствора 4-сук циноилдезацетилвинбластинового слож ного И-гидроксисукцинимидового эфира в ДМФА добавляют при быстром перемешивании к 2,0 мл 20,0 мг/мл раствора моноклонального антигена антикарци номы легких малых клеток легких мыши 0,34 М боратном буфере с рН 8,6.После перемешивания при комнатной температуре в течение 4 ч реакционную смесь, доводят до рН 7,4, используя НС 1, и 50 очищают центрифугированием. Продукт выделяют с помощью гель-фильтрации на 2,0 22,0 см (67,0 мл) колонке БиоГель Р, уравновешенной растворомсоли с фосфатом в качестве буфера.Исключенный пик собирают (9,7 мл) и подвергают анализу на содержание дезацетилвинбластина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм, Конь 046югат, полученный таким образом, содержит 7,5 моль дезацетилвинбластина на моль ИГ,Данные концентрации и УФ-поглощения по примерам 1-7 приведены в табл. 1. П р и м е р 8. Способ полученияклеток, растущих в культуре. Их помещают в микротитровые трубки до уровня 10 клеток на трубку. Путем консцентрирования клеток центрифугированием добавляют 0,2 мл аликвот различных концентраций.конъюгатов. Клетки пересуспендируют, инкубируют при37 С в течение 30 мин, затем центрифугируют и удаляют всплывшую часть,Клетки затем суспендируют на тканевой культуре и помещают на микротитровые подносы для культур при уровнев 10 клеток на емкость. Через шестьдней в культуре определяют количество присутствующих клеток в каждойемкости и сранивают с клеточной формой приготовления, обработанной раствором соли с фосфатом в качестве буфера,В одном эксперименте клетки меланомы человека обрабатывают либо виндезинсукциноиловым конъюгатом моноклонального антимеланомного антигена мыши (пример 3) или дезацетилвин7 1362404 кристинсукциноиловым конъюгатом моноклонального антимеланомного антигена мыши (пример 6) и устанавливают действие на рост клеток получая ре 5 зультаты приведенные в табл, 2.В другом эксперименте клетки колориктальной карциномы человека об.рабатывают виндезинсукциноиловым конъюгатом моноклонального антикари циноэмбрионного антигена мыши (приг мер 4), получая результаты, приве денные в табл. 3. Продолжение табл.3 30 89,9 104,8 15 П р и м е р 9. Для того, чтобыспытать дп тло действенность конъюатов в качестве противоопухолевыхгентов группам мышей без волочковойжелезы подкожно имплантируют клеточную суспензию колоректальной карцино мы и далее обрабатывают дважды в неделю с помощью внутрибрюшинных инъекций в течение пяти недель. Мышам вводят либо моноклональное антитело (про-,тивокарциномоэмбрионный антиген) мы О ши с раствором соли с фосфатом в качестве буфера или виндезиновый коньюгат этого антитела, приготовленный,аналогично тому, как это описано впримере 4. Доза антитела, которую .вводят за одну инъекцию мыши, варьируетмежду 3,3 и 3,7 мг. Доза виндезинав конъюгате дляинъекции за один разна мышь составляет 119-128 Иг.Спустя 61 день после того, как им- ЗО плантировали опухоль, убивают группы,получавшие ПБС или одно антитело,опухоли извлекают и взвешивают. Мышей же, получивших виндезиновые коньюгаты с антителами, убивают спустя ЗБ 90 дней после имплантации опухоли.Средние значения веса опухолей показаны в табл, 4. Та блица 2 Концентрация конъю- гированного лекар- ственного Конъюгированный лекарственный препарат ост клеток ак Х контольныхлеток, обаботанных раствором соли с фосфатом в качестве бу- фера препарата,мг/млВиндезин 16 50 61,8 5,0 84,2 0,5 21,5 50 Дезацетил- винкристин 74,5 5,0 100,0 0,5 Таблица 4 40 а 3 Таб Группа, получив- Колишая лекарства чествомышей едний вес о холеи, мгфС.Д 5 ПБС 179311609 7147 10 ТолькоО итело Виндеэинантителовый конъюгат 120 22 ф 1 НИИПИ Заказ 6306/59 Тираж 372 ПоцписноР оизв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4