Способ определения ди-п-метокситритил ацилдезоксирибонуклеозидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ОЮ (И) 511 С 01 Б 31/16 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ13К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 5 ллтгъ3(56) . Веверис А,Я., Спинце Б.А.и Смолова НТ, Дифференцированноеацидометрическое определение компонентов нуклеиновых кислот, их производных и смесей в среде метилцеллозольва - БАХ, 36, 1981, У 11,с. 2231-2235.2. Карлиня В,А Янсон Э,Ю.,БирскаИ.А. и Веверис А.Я. Спектрофотометрическое определение 2-дезок(сирибонуклеозидов по цветной реак/ции 2 -дезоксирибозы с дифениламином - "Известия АН Латвийской ССР",сер. хим., 1983, У 1, с. 122-123.3. ЯсЬа 11 ег Н., Уе 1 шаппд., 2 егсЬ В,КЬогапа Н., я Ягпйьев оп ро 1 упцс 1 еогЫез, ХХ 1 Ч ТЬе Ягерюзе зупСЬездз оЕ зресдЯс йеохугЬо-ро 1 упис 1 еоСЫез, Ргойесгей йегчаМез оК йеохугдЬопис 1 еоСЫез апй пед зупйЬезз.оЕ йеохуг 1 Ьоппс 1 еозЫе-рЬозрЬайев.(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИ-О-ИЕ-. ТОКСИТРИТИЛ- АЦИЛДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИДОВ с использованием раздельного определения основания нуклеозида и ди- П-метокситритильных групп в среде органического растворителя, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения точности и упрощения способа, проводят раздельное определение основания нуклеозида и ди-метокситритильных групп дифференцированным потенциометрическим неводным титрованием в среде нитрометана хлорной или хлористоводородной кислотой, причем после оттитровывания основания нуклеозида в анализируемый раствор Е добавляют органическую кислоту или хлорид тяжелого металла.Изобретение относится к количественному определению ди-П-метокси, тритил-ацилдезоксирибонуклеозидов, которые являются исходными соединениями для синтеза олигонуклеотидов и представляют актуальное значе-.ние в генной инженерии,Для оценки пригодности препаратовдля дальнейших синтезов полинуклеотидов необходимо охарактеризовать ихкак по основанию нуклеознда, так и,по количеству ди-П-метокситритильныхтрупп.Известен метод потенциометрическо го титрования пиримидиновых и пуриновых оснований в метилцеллозольве 1) .Метод имеет ограниченное применение для анализа 8 -ацилдезоксирибонуклеозидов вследствие слабо выражен рных основных свойств последних в метилцеллозольве,. Метилцеллоэольв также неприменим для проведения титрования ди-П-метокситритильных групп.Известен метод спектрофотометрического определения дезоксирибонуклеозидов по цветной реакции дезоксирибозы с дифениламином 2 .Недостатком указанного метода является то, что он дает характеристи- ЗОку анализируемого вещества только подезоксирибозной части молекулы.Наиболее близким по достигаемомурезультату к предлагаемому являетсяспектрофотометрический способ количественного определения ди-П-метокси.тритил-и-ацилдеэоксирибонуклеозидовйутем раздельного определения основания нуклеозида и ди-П-метокситритильных групп.Для определения основа Ония нуклеозида навеску вещества растворяют в этиловом или метиловомспирте и измеряют оптическую плотность раствора в УФ-области спектра,Для определения содержания ди-П-ме 45токситритильных групп .навеску растворяют в смеси этанола с 703-нойхлорной кислотой (при объемных соотношениях 1:1) и измеряют оптическуюплотность при 500 нм, Количество определяемых групп находят по калибровочному графику 3 .Недостатками способа являются низкая точность, трудоемкость и дли55тельность анализа,Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа. Поставленная цель достигается тем,что, провоцят раздельное определениеоснования нуклеоэида и ди-р-метокснтритильных групп дифференцированномпотенциометрическим неводным титрованием в среде нитрометана хлорнойили хлористоводородной кислотой,причем после оттитровывания осно- вания нуклеозида в анализируемый раствор добавляют органическую кислоту или хлорид тяжелого металла.Упрощение процесса и сокращение егодлительности достигается дифференцированным потенциометрическим титрованием основания нуклеозида иди-П-метокситритильных групп. Это позволяет определить оба компонента в одной навеске образца. В среде нитрометана основания ди-П-метокситритил-ацилдезоксирибонуклеозидовпроявляют довольно вьфаженные основные свойства и титруются неводнымраствором сильной кислоты. Ди-и-метокситритильные группы в нитрометанеосновных свойств не проявляют, однако после добавления к раствору бензойной кислоты, уксусной кислотыили солей тяжелых металлов эт группы титруются с довольно выраженным скачком потенциала. По-видимому, в присутствии названных веществ происходит разложение ди-П-метокситритил- И-ацнлдезоксирибонуклеозидов с образованием ди-П-метокситритилкарбинола, который в данной среде под деиствием этих соединений проявляет основные свойства. Использование других органических растворителей, применяемых для дифференцированного потенциометрического титрования очень слабых органических оснований, например ацетона, метилэтилкетона и ацетонитрила позволяет провести титрование основания нуклеозида, но недает возможности осуществить потенциометрическое определение ди-П-метокситритильных групп. Для обеспечения дифференцированного потенциометрического титрованияоснования нуклеозида и ди-П-метокситритильньпс групп органическую кислоту или хлорид тяжелого металла вводят только после оттитрования основания нуклеозида, так как добавление реагента в начале титрования приводит к нивелированию основных свойств определяемых компонентов и их совместному титрованию.11335Способ осуществляют следующим образом.Навеску анализируемого вещества 7- 10 мг растворяют в 5-10 мл очищенного нитрометана, в раствор погружают пару электродов (стеклянный и каломельный) и потенциометрически титруют из бюретки емкостью 2,5 мл 0,02- 0,03 н, неводным раствором хлорной или хлористоводородной кислоты до 1 О появления скачка потенциала на кривой титрования. Затем в раствор вводят приблизительно 0,01-О, 1 г органической кислоты или хлорида тяжелого металла, перемешивают 1-2 мин 15 ,и продолжают титрование до появления второго скачка потенциала на кривой. Первый скачок потенциала соответствует оттитрованию основания нуклеозида, а второй - оттитрованию 2 О ди -1)-метокситритильньм групп. При анализе чистого образца объемы титранта на титрование каждого компонента одинаковы, Различия объемов израсходованного титранта на титра вание основания нуклеозида и ди-цметокситритильных групп свидетельствует о несоответствии качества тре-, бованиям однородного препарата. Например, если на титрование основания нуклеозида израсходовано больше титранта, чем на титрование ди-и-метокситритильньм групп, образец содержит свободный нуклеозид и, следовательно, препарат не может быть применен для синтеза олигонуклеозидов.35 П р и м е р 1. Количественное определение ди-й-метокситритил-М-бенЮзоилдезоксицитидина.7 435 мг ди-и-метокситритил- 4 О)бенэоилдеэоксицитидина растворяют в 5 мл нитрометана, в раствор погружают пару электродов (стеклянный и каломельный) и потенциометрически титруют 0,0215 н,раствором хлорово дородной кислоты в диоксане до появления скачка потенциала на кривой титрования, затем к раствору добавляют щ 0,01 г хлорида цинка, перемещивают 2 мин и продолжают титрование до по О явления второго скачка потенциала. На титрование основания нуклеозида .израсходовано 0,466 мл (Ч ) титранта, а на титрование ди-р-метокситритильных групп 0,468 мл ( Ч ) Поскольку 55 Ч "-Ч, можно считать, что препарат не содержит свободного Й -ацилдезокси,нуклеозида и ди-П-метокситритилкар 50 абинола. По данным титрования рассчитывают либо содержание основания нуклеозида и тритилгрупл, либо содержание основного вещества. Рассчитывают содержание ди-л-метокситритил- И -бензоилдезоксицитидина0 466 фО 0215 фб 34Х -- д --- д ----- , 100=85, 4 Х7,4350469 е Од 0215 634 7,435 П р и м е р 2. Количественное определение ди-П-метокситритил-изобутирилдезоксигуанозина,8,516 мг ди-и-метокситритил-Низобутирилдезоксигуанозина растворяют в 10 мл нитрометана и потенциометрически титруют 0,0289 н,растворомхлористоводородной кислоты в ацетонит.риле до появления скачка потенциалана кривой титрования. Затем к раствору добавляют О, 1 г уксусной кислоты, перемешивают 1 мин и продолжают титрование до появления второгоскачка потенциала на кривой, На титрование основания нуклеозида израсходовано 0,419 мл (Ч) титранта, ана титрование ди-л-метокситритильныхгрупп 0,452 мл ( Ч ) . Как видно, Ч,сЧчто свидетельствует о наличии примеси ди)-метокситритилкарбинола. Поэ,тому для расчета содержания ди-рметокситритил, - изобутирилдезоксигуанозина используют Ч,0 419 ф 0,0289 653 100 928,516Содержание примесей ди-)-метокситритилкарбинола рассчитывают по разнице Ч и 7(О 452-Од 419) ф 0 0289 320 008,5163,6 Е,П р и м е р 3. Количественное определение ди-м-метокситритил-бензоил-дезоксиаденозина,9,885 мг ди-П-метокситритил-Нбензоил-дезоксиаденозина растворяют в 8 мл нитрометана и потенциометрически титруют 0,0258 н,раствором хлорной кислоты в диоксане до появления скачка потенциала на кривой титрования. Затем к раствору добавляют О, 1 г бензойной кислоты, перемеши(Од 543-0 463) О 0258 371 00-7 77 207, 532фо Од 645. Од 0229 653459,630у 0 вают 1,5 мин и продолжают титрование до появления второго скачка потенциала на кривой, На титрование основания нуклеозида израсходовано О, 543 мл ( 7 ) титранта, а на титрование ди-П-меток ситритильных групп 0,463 мл ( У 2), Как видно, 1 1, что свидительствует о наличии прймеси нуклеозида. Поэтому для расчета содержания ди-и-метокси 1тритил-Й-бензоил-дезоксиаденозпна 10 используют Ч Содержание примесей М -безоилдезоксиаденоэина рассчитывают по разнице Ч иП р и м е р 4. Количественное определение ди-П-метокситритил-я-изобутирилдезоксигуанозина 259 630 мг ди-й-метокситритил изобутирилдеэоксигуанозина растворяют в 10 мл нитрометана и потенциометрически титруют 0,0229 н,. раствором хлорной кислоты в ацетонитриле до пор явления скачка потенциала на кривой титрования. Затем к раствору добавляют0,01 г хлорида никеля, перемешивают ъ 1 мин и продолжают титро.вание до появления второго скачка потенциала на кривой титрования. На титрование основания нуклеозида израсходовано О, 647 мл. ( 1,) титранта, а на титрование ди-й-метокситритильных групп 0,650 мл ( Ч). Содержание ди-П-метокситритил-изобутнрилгуа,козинаОд 640 0 02296539,630у О П р и м е р 5. Количественное определение ди-Я-метокситритил-бен 0 з оилдез оксиаденоз ина,7,532 мг анализируемого образца растворяют в 10 мл нитрометана и потенциометрически титруют 0,024 1 н, раствором хлорной кислоты в диоксане до появления скачка потенциала на кривой титрования. Затем к раствору доб авляют О, О 1 г хлорида к об альта, перемешивают л 1 мин и продолжают титрование до появления второго скачка потенциала на кривой титрования, На титрование основания нуклеозида израсходовано 0,420 мл титранта ( 11), а на титрование ди-И-метокситрнтильных. групп 0,422 мл (Ч ) . Содержание ди-Л-метокси-Й-бензоилдезоксиаденози- на В таблице приведены сравнительные метрологические характеристики предлагаемого и известного способов определения ди-П-метокситритил-ацилдезоксирибонуклеозидов,Таким образом, предлагаемый способ точнее, значительно проще в сравнении с известным сокращена длительность. По известному способу необходимо проводить два параллельных определения, причем для определения дни -метокситритильных групп необходимо строить калибровочный график, поэтому определение занимает 1,5- 2 ч рабочего времени и требует нали- чия стандартного вещества в виде чистого препарата ди-и-метокситритил- ацилдезоксинуклеозида. Определение по предлагаемому способу занимает всего 15-20 мин и не требует применения в качестве стандартных веществ препаратов тритилдезоксинуклеозидов. Кроме того, способ позволяет проводить анализы в микромасштабе, поэтому на анализ расходуется несколько миллиграммов дорогостоящего анализируемого вещества.1133550 81.Известный способ Предлагаемый способ Показатели Определениенуклеозида Определениедн-П-метокситритилгрупп Определениенуклеозида Допустимое расхоздениемелду 5 параллельнымирезультатами, Х 1,2 2,1 Среднее квадратичное,отклонение результатаизмерения, 3 0 18 0,20,0,15 Доверительные границыслучайной погрешности при Р 0,95, Х 1,61 0,51 0,33 0,39 2,9 0,4 0,4 Систематическая погреш ность проведения анализа, Х 3,5 0,9 0,6 2,7 Суммарная систематичес"кая погрешность, Х 4,4 3,5 1,0 0,8 Составитель В.Шкнлькова Редактор В.Петраш Техред Л.Иикеш Корректор Н. Король Заказ 9945/38 Тираа 898 . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Уагород, ул. Проектная, 4 Систематическая погрешность стандартизации титранта Гпредлагаемый способ) ипи построения калибровочного граФика (известный способ) Определениеди-й-метокситритилгрупп