Способ получения биоспецифического сорбента

(54) (57) СПОСОБ ЧЕСКОГО СОРБЕНТ осн га лем, отличчто, с целью упвышения химичес в качестве лигандсиуриднн -2 (Я 5носителя - модифи алюминия макро иазотированными ами, а процес 0 С и р СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Ордена Ленина институт элементоорганических соединений им. А.Н.НесФмеянова и Научно-производственное объединение "Биохимреактив"53) 577.15 (088.8)(56) 1. 1 егч)з , Н.М. Рейй 1 с).СЬгоп)айодгарЬу, 1974, 97, 33-38.2. Ч 11 с 1)е 1 с М., Оогес 1 с 1 М. "Ме 01 одз 1 п Епзуво 1 оду", 1974. 34, В, 492-496.3. Авторское свидетельство СССР Р 688431, кл, С 01 В 33/12, 1977. ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИпутем связыванияе уридина с носитею щ и й с я тем,ощения процесса и поой стойкости сорбента,а используют 5-окдифосфат, в качествецированный солямиристый кремнезем саминоарильными групосуществляют при 4идрированием 107 ны угле, Полученный лиг и смешивают с нафтал стеклом в 0,5 М бика ре рН 9,0, Реакцию п чение 1 ч при 40 С, б сорбент отделяют филОднако данньй спо биоспе ического о нд диазотируютнсодержащимбонатном буфеоводят в теоспецифическийтрованием 1,об получениябен НМ ОР - О+ ОНсоб имеет ряд со сложностью Я используесорбенты на осно дают достаточной стью и хиическо того, образующая между аминами и достаточно прочна нуклеофилов лабил ет работу с даннь е ы н кой облапрочно Кроме связь ех ст че ос оторого осноФицитных вента фосфодида) и длится его непосреднтез сорбенльзования в активированя сс ф г Мзон и в Р т б стви на з удняе споФ ойкосЦель изобр соба и повыше ти сорбента Указанная что согласноения - упрощени е химической ст известно, явоединением,цель достнга способу попу тся ени ем,бо 1 10575Изобретение относится к способам получения биоспецифических сорбентов, используемых в аффинной хроматографии ферментов, имеющих сродство к компонентам нуклеиновых кислот. 5Известны способы получения биоспецифических сорбентов, содержащие в ка честве иммобилиэованного лиганда нуклеозид,5-дифосфаты. Например,,1 1известен способполучения сорбента на основе гуанозин(3,5-дифосфата, согласно которому носитейь - пористое. стекло подвергают взаимодействию с 3-аминопропилтриэтоксисиланом в течение 6 часов, полученное аминопро пилированное стекло обрабатывают р-нитробензоилхлоридом, восстанавливают нитрогруппу дитионитом натрия в водном растворе. Полученное аминоарильное производное стекла диазоти руют, затем добавляют 1,5-диоксипафталин из расчета 100 мг наг сорбента в растворе ацетата натрия, нафталичсодержащее стекло отфильтровывают на фильтре, В качестве лиганда 25Р используют 5- (4-аминофенйлфосфорил)- гуанозин(3(-монофосфат, который получают конденсацией гуанозин,3-циклофосфата с р-нитрофенилфосфатом с использованием в качестве Конденсирую- З 0 Однако известныи сп недостатков, связанных и трубоемкостью получени мого лиганда, сийтез к ван на использовании д ществ (например, ферме эстерезы иэ змеиного. я несколько дней, после ч ственно осуществляют си та; необходимостью испо качестве носителя ВгСМ" ной сефарозы (ВгСМ, как ляется высокотоксичным 14 з щего агента дициклог ксилкаободиимида, Нитрогруппу в сстанавливают до аминогруппы ка алитическимпалладием .на иф с р та очень сложен н трудоемок. Синтез сорбента занимает не менее двух недель.Используемая в способе обработка стекла 3-аминопропилтриэтоксисиланом влияет на проявление сорбентом анионообменных свойств, что снижает селективность очистки.Наиболее близок к редлагаемому по технической сущности способ получения биоспецифическо о сорбента на основе уридина, котор й заключается в том, что лпганд -производное фосфорилированного уриди а связывают с носителем - ВгСМ-актиированной сефарозой при 4 С и рН ,0 (2,Схема получения да ного сорбента может быть выражена с едующим обра - эом:О ОЗзз 2 гН Э 0575 специфического сорбента путем связывания лнганда на основе уридина с носителем в качестве лиганда используот 5-оксиуридин(35-дифосфат, в качестве носителя - модифицированный солями алюминия макропористый крем 1, у - эпоксиаропилсилон2. НС 1згог - О-Зг. снгг о-снгсн-снгонОНг, огн С) сг. н Синтез лиганда начинают с введения гидроксильной группы в пятое положение пиримидинового ядра. Для этого уридин растворяют в бромной воде и обрабатывают свежеперегнанным пиридином при нагревании до 120 С в течение 50 5-12 ч. Затем реакционную массу упаривают и остаток кристаллизируют из этанола. Полученный 5-оксиуридин тщательновысушивают над Р 20 и фосфорилируют полифосфорной кислотой при 5580 С в течение 4 ч. Затем избыток0полифосфорной кислоты разлагают водой при 120 С, а продукт фосфорилирования 4 4,неэем с диазотированными аминоарильными группами, а процесс осуществляют при 4-10 С и рН 6-8.Способ осуществляется по следующей схеме (показаны и стадии подготовки носителя и синтеза лиганда); выделяют анионаобменной хроматографией.Синтез сорбента ведут исходя из кремнеземов, модифицированных солями алюминия 3, покрытых органическими полимерами с гидроксильными группами. Органические полимеры на поверхность кремнеземов вводят, обрабатывая кремнезем силаном, содержащим эпоксигруппы, которые при размыкании дают диольную группировку, Для введения аминоарильной группы гидроксилсодержащие органокремнеземы в кипящем толуоле обрабатывают в течение5 0575 3 ч р-нитробенэоилхлоридом с добавлением триэтиламица. Нитрогруппу восстанавливают дитионитом натрия при 60-80 С в течение 2 ч. Получецный сорбент суспендируют в 2,5 н,соляной кислоте, добавляют цитрит натрия и перемешивают 30 мин при 41 С, затем промывают буфером при рН 6-8 и активировацныц сорбент суспендируют в том же буфере, содержащем 5-ок сиуридин-. 1 О)2 3) 5-дифосфат и перемешивают при 40 С в течение 4-12 ч.Предлагаемый способ более прости менее трудоемок, не требует использования высокодефицитных и токсичных реактивов как в процессе получе 40 ния самого сорбента, так и в процессе синтеза исходных. Общая продолжительность в 4 раза меньше, чем в известном способе учитывая стадии подготовки лиганда и носителя),Биоспецифический сорбент, получаемый предлагаемым способом, обладаетвысокой химической стойкостью, таккак не содержит гидролитически лабильных связей, как в случае биоспецифического сорбента, получаемого по способу прототипуВысокая химическая стойкостьвозрастает также вследствие исполь- З 0эования модифицированной солями алюминия кремнеэемной основы . Стабильность кремнеземного сорбента послетакой модификации возрастает в Ои более раэ,35Кроме того, получаемый сорбентхарактеризуется низкой неспецифической сорбцией менее 10 мг белкана 1 г сорбента), так как в способепредусмотрена обработка кремнеземной основы неионногенными органическими полимерами, а кроме того,иммобилизованный лиганд удален вдва раза дальше от поверхности нерастворимого носителя, чем в способе 45прототипе.П р и м е р 1. 3 г уридина растворяют в 15 мп воды, добавляют бромдо слабого пожелтения раствора, при,пивают 15 мл пиридина и растворнагревают в течение 5 ч при 120 С50Затем упаривают насухо и остатоккристаллизуют из этанола. Получают1,3 г 5"оксиуридица, который высушивают 6 ч над РО 5 в вакууме масляного насоса, а затем растворяютв 25 г полифосфорйой кислоты и перемешивают 4 ч при 80 С до образова 01ния прозрачной гомогенной массы, 4 6Добавляют 20 мл воды и раствор нагревают 20 миц прц 120 С, Охлаждают иодоводят рН до О с пом щью 4,5 ц. гидроокиси лития. Осадок отфильтровывают, и супернатант, содержащий продукты фосфорилировация наносятЭца анионообмецник и разделяют обычным способом, Получаютг 5-оксиуридиц(Зу 5-дифосфата. К 25 ге,модифицированного солями алюминия склохрома в 350 мл толу 10 мл 3 (2,3-эпоксипропо триметоксисилана, кипят шивании 8 ч, промывают ацетоном, суспецдируютвора НС 1 в а етоне 0 1 м ла добавляют си)-пропилт при перемеолуолом и 500 мл раст- оль фический сорбент промыв т 1 И МаС 1, водой и ацетоном и высуш вают в вакууме масляного насоса. орбент содержит около 35 ммоль лиганда ца 1 г сорбента.П р и м е р 2. Процесс ведут аналогично примеру , но 5-оксиуридин/и 12 Ьу 5-дифосфат берут в количестве 0 2 г. Синтези ован " специфичеУ р ныи б о ский сорбент содержит 7 да на 1 г сорбента,П р и м е р 3. Процесс логично примеру 1, но при лиганда к актйвированному ведут в течение 4 часов и П р и м е р 4, Процесс гично примеру 2, но присо лиганда к сорбенту провод рН 6, оль лиганведут анаоединениесорбентуи 10 С.ведут аналодицециет при Ц /г и пере мешивают 2 ч при 20 С. Сорбент промывают на фильтре ацетоном, высушивают в вакууме масляного асоса, суспендируют в 250 мл абсолютного хлороформа, содержащего 12,5 г хлорангидрида р-нитробенэойной кислоты и 9,4 мл триэтиламина. Смесь кипятят при перемешивании 3 ч , отмывают на фильтре хлороформом, ацетоном и водой и суспендируют в 300 мл 102-ного водного пиридина, содержащего 25 г растворенного дитионита натрия (Ма 5 04)724 и нагревают при 60-80 С в течение 2 ч. Аминоарильное производное органсилохрома промывают на фильтре водой и суспендируют в 5 О мл 2,5 н. НС 1. Смесь охлаждают до 4 С, при 0 бавляют 10 г Най 02 перемешивают 30 мин, промывают 0,2 И ацетатцым буфером при рН 7,6, затем суспендируют в 200 мл того же бу ера сот держащего 1 г 5-оксиуридин 2 (3) 5-дифосфата и перемешивают п 1 и 4 оС в течение 12 ч. Синтезированны,биоспециСоставитель О. СкородумоваРедактор Л. Пчелинская Техред М.Костик, Корректор И. Эрдейи Заказ 9521/30 Тираж 387 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 7 10575Использование предлагаемого способа позволяет;получать биоспецифические сорбенты, т.е, сорбенты для взаимодействия с белками, имеющими сродство к компонентам нуклеиновых кислот.Получаемые предлагаемым способом биосецифические сорбенты характеризуются высокой химической и микробиологической устойчивостью из-за использования кремнеэемной основы; низкой 10 неспецифической сорбцией, так как в способе предусмотрена обработка крем 14 8неземной основы неионогенными органическими полимерами; высокой селективностью взаимодействия вследствие значительной удаленности иммобилизованного лиганда от поверхности кремнезема в результате однозначности связывания лиганда с сорбентом,В предлагаемом способе используется носитель, выпускаемый отечественной промыпшенностью, что позволяет осуществить крупномасштабное производство биоспецифического сорбента.