Способ получения активированных носителей

ос . Фема ттаттен н,м %к е -ефаФи ,еетмав ч 4 Фф ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскнкСоциалистическихРеспубттнк(5 )М. Кл,С 07 С 7/02 Государстевнный комитет по делам нзооретеннй н открытий,07(088.8) Дата опубликования описания 10,07.81 А,И.Кестнер, Х.Я.Киппер, К,А.Кивисилла, Х.Р-В,Егоров, А.Э.Зрин, А.К.Арен и Д,Я.Дайя(72) Авторы изобретения Таллинский политехнический институт и Всесоюзный научноисследовательский институт прикладной биохимииНПО "Биохимреактив"(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ НОСИТЕЛЕЙ Изобретение относится к способуГ получения активированных водонераст- воримых носителей для иммобилизации белков. Иммобилизованные на таких сорбентах ферменты могут быть применены как химические реактивы и про"-" мышленные катализаторы для проведе- ния ферментативных реакций в химической, Фармацевтической и пищевой отраслях промьппленностй.Иммобилизация ферментов путем их30 присоединения к нерастворимым нбси-телям.является одним из наиболее известных способ улучшения технологи" ческих показателей этих биокатализа)5 торов. Метод иммобилизации ферментов заключается в присоединении их к активированным носителям, причем свойства получаемых катализаторов во многом зависят от способа получения и активации носителя, В качестве, носителей часто используют органоминеральные материалы, в частности, по- крытые полимерами пористые кремне 2земные материалы. Носители такого типа характеризуются-хбрбййми гидродинамическими свойствами и достаточной стабильностью получаемых препаратов, свойства которых во многом, зависят от метода внесения и активации полимерного слоя на носителе.Известен способ получения модифицированных твердых носителей путем покрытия поверхности носителя полимером, в качестве которого используют полиакролейн 1 . Слой полимера образуется на поверхности носителя в результате пропитывания носителя мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Полимеризация происходит"на поверхности носителя. Иммобилизация фермента производится по реакцйи между альдегидными группами носителя и, аминогруппами фермента.Такой способ позволяет получить иммобилизованные на органоминеральных носителях ферменты, однако он64468 4 3 Ьограничивает модификацию носителятолько альдегидсодержащими полимерами. Связывание Ферментов через альдегиды не всегда позволяет получитьактивные препараты. Кроме того,получаемые линейные полимеры обладают значительной растворимостью ине скрепляют неорганическую структуру носителя,Известен также способ полученияактивированного твердого носителя,пригодного для приготовления водонерастворимых Ферментных перпаратов,На поверхности носителя в результате полимеризации образуется слойполимера 2, в качестве которогоиспользуют полиакролеин, Носитель(Фарфор, измельченное стекло) пропитывают мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Полиме-ризация происходит на поверхностиносителя,В результате модификации носителятаким способом получают носитель сосвободными альдегидными группами.Иммобилизация Фермента (трипсина,папаина) производится через реакциюальдегидных групп носителя с аминогруппами фермента.Недостатком этого способа является малая операционная стабильнос 1 ьполучаемых активированиых носителей. Покрытие неорганического материала линейными полимерами, образующимися при полимеризации винильнйхполимеров, не обеспечивает достаточную нерастворимость и, следовательно, стабильность получаемых Ферментных препаратов. Такой способ ограничивает модификацию носителя толькоальдегидсодержащими полимерами, асвязывание Ферментов через альдегидные группы не всегда дает возможностьполучить активные препараты. Крометого, способ не обеспечивает высокого содержания белка на единицу носителя. При иммобилизации трипсинадостигается связыванием 0,2 мг белка на 1 мл носителя.Цель изобретения - повышениеоперационной стабильности носителейдля иммобилизации биоактивных веществ.Это достигается известным способомполучений активированных йоаителейдля иммобилизации белков путем покрытия пористого Георганического материала с диаметром пор 200-2000 А 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пленкообразующим веществом, в ка"честве которого используют эпоксиднуюсмолу и отверждают ее на носителеполиэтиленполиамином или 1,б-гексаметилендиамином в соотношении эквивалентов эпокеидной смолы и амина1:0,25 при 100-120 оС в течение неменее 1 ч.Способ осуществляют следующим образом, 5 вес. ч. силохрома илисиликагеля смачивают 9 вес. ч.1,7 эпоксидной смолы в ацетоне.После выпаривания растворителя при100 ОС проводят затвердение полиэтиленполиамином или 1,б-гексаметиллендиамином посредством кипяченияв их водных растворах в течение 1 ч(соотношение эквивалентов эпоксид 3ной смолы и амина 1:0,25). Носительфильтруют, промывают водой и высушивают в термостате при 100 С. Получают носитель, содержащий на поверхности пор пленку с активными эпоксидными группами, способными к непосредственному присоединению биоактивных йеществ.При таком способе можно провестиполимеризацию при повышенной температуре, способствуя этим образованиюпоперечных связей между молекуламиполимера, а также связей между полимером и"новерхностью носителя. Образование в порах носителя полимернойпленки закрепляет структуру носителМ, уменьшает нежелательное адсорбционное воздействие молекул Фермен-,та с носителем и предотвращает вымывание Фермента с носителя из-зарастворимости кремнезема при рН 7и вьппе,П р и м е р 1, Получение носителя, активированного эпоксиднойсмолой с последующим затвердениемполиэтиленполиамином.Для получения носителя проводятпропитывание кремнеземного материалараствором эпоксидной смолы и затемзатвердение водным раствором поли"этиленполиамина, который берется вколичестве 25% от эквивалентногоколичества эпоксидной смолы.5 г силохрома или силикагелясмачивают 9 мл раствора 1,7 эпоксидной смолы в ацетоне. После выпаривания растворителя при 100 С проводят затвердение 15 мл водным раствором полиэтиленполиамина кипячением йрй 100 ОС в течение 1 ч. Затем664468 5носитель йильтруют, промывают водой и высушивают в термостате при100 о С.Способность используемой эпоксидной смолы к привязыванию аминасоставляет 2500 мк экв/г (определена кипячением смеси смолы с избыт-.ком амина при 100 оС в течение 1 чи обратным тычрованиемнепрореагировавшего амина кислотой). 5 г но- Осителя покрывается О,53 г (90,01)смолы, способность к привязываниюамина которой составляет 383 мк экв/г(0,2538375),Получают активированный носитель,содержащий на поверхности эпоксидныегруппы в количестве 65 мк экв на 1 г 20носителя (определено по способу, опи. санному в данном примере).П р и м е р 2. Получение носителя, активированного эпоксидной смолой с последующим затвердением 1,6- 25-гексаметилендиамином.Для получения носителя проводятпропитывание кремнеземфого материала раствором эпоксидной смолы и затем затвердение водным раствором 1,6- 30-гексаметилендиамина, который берется в количестве 25 от эквивалентного количества эпоксидной смолы.5 г силохрома или силикагеля смачи вают 9 мл раствора 1,эпоксидной зюсмолы в ацетоне, После выпариваниярастворителя при 100 С проводятзатвердение 15 мл водным раствором1,6-гексаметилендиамина кипячениемпри 100 оС в течение 1 ч. Затем носи- Отель фильтруют, промывают водой и высушивают в термостате при 100 С./ При использовании эпоксидной смолы со способностью к привязыванию ф амина 2500 мк экв/г необходимое количество 1,6-гексаметилендиамина, содержащееся в 15 мл раствора, составляет 5,6 мг (0,25383 ф 58) .Получают активированный носитель, 50 содержащий на поверхности эпкосидные группы в количестве 50 мк экв на 1 г носителя.П р и м е р 3. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, акФивированного эпоксидной смолой с последующим затвердением полиэтиленполиамином.45 г актнвированного эпоксиднойсмолой носителя (пример 1) смачивают 8 мл боратным буфером с рН 8,0.Смесь перемешивают и вакуумируют15 мин для удаления воздуха из пор.Затем добавляют 5 мл раствора химотрипсина с концентрацией 40 мг/млв боратном буфере с рН 8,0, перемешивают и выдерживают при 20 ОС в течение 2 ч. После инкубации препаратпромывают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0, 1 М раств ромхлористого натрия и затем еще боратным буфером, добавляя эти растворыпорциями. Объем промывных вод составляет 100 мл, Полученный иммобилизованный препарат хранят в боратномбуфере в холодильнике,Ферментативную активность пре-.парата определяли на 2 раствораказеина. Активность равнялась39,7 Е/г. Стабильность препаратаоценивали по остаточной активностипосле проведения промывки препарата 100 мл 2%-ным раствором казеинарН 8,0 в колонке с диаметром 6 мми высотой столба препарата 70 ммв течение 24 ч. После такой промывки сохранялось 29 от исходной активности,П р и м е .р 4. Получение нерастворимого ферментного препарата сиспользованием носителя, активированного эпоксидйой смолой с последующим затвердением 1,6-гексаметилендиамином.5 г активированного эпоксиднойсмолой носителя (пример 2) смачивают 8 мл боратным буфером с рН 8,0.Смесь перемешивают и вакуумируют15 мин для удаления воздуха из пор.Иммобилизацию Фермента проводят какописано в примере 3. Получают препаратхимотрипсина с активностью на 2 казеина 36,7 Е/г. После промывки препарата 2 -ным раствором казеина сохранялось 20 исходной активности.предлагаемый способ позволяетполучать носители для иммобилизациибиоактивных веществ с повышеннойоперационной стабильностью, в которых внутренняя поверхность пор покрыта слоем нерастворимого полимера,содержащего эпоксидные группы, дающие возможность иммобилизации ферментов в укрунненнолабораторноммасштабе, в том числе и Ферментов,нуждающихся в высоких значениях рН.7Такой способ дает возможностьполучить препараты химстриппина,сохраняющие активность при 4 ОС втечение 1-2 месяцев, что являетсяпредпосылкой для достижения высокойоперационной стабильности препаратов.Данный способ позволяет по сравнению с известным способом связывать в 10-20 раз больше белка на едийицу носителя. Формула изобретения Способ получения активированных носителей для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, содержащим реакционноспособные группы,Составитель А.БочаровТехред С. Мигунова Редактор С.Суркова Корректор М.Демчик Заказ 4508 17 Тираж 397 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Филиал ППП Патент , г. Ужгород, ул. Проектная, 41 юФфффф".4 м 5 Ф "4мс .флфФчсф,с., ад ф. Фч664468 8о т л и ч а ю щ и И с я тем, что,с целью повышения операционной стабильности получаемых материалов,при покрытии пористого неорганического материала с диаметром порФ200-2000 А в качестве пленкообразующего вещества используют эпоксид-ную смолу и отверждают ее на носителе полиэтиленполиамином или 1,610 -гексаметилендиамином в соотношенииэквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:0,25 при 100-120 С в течениене менее 1 ч.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Патент ФРГ Р 2229298,кл. С 07 6 7/02, опублик. 1974.2. Патент Великобритании9 1342186, кл. С 08 Н 1/02, опублик.20 1973 (прототип),