Способ количественного определения замещенных цефалоспоринов

401 СО)ОЭ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 4 А 1) а 01 И 31 0 РЕТЕНИ САНИЕ И юл. В .38ский, В.-ЮВ.К.КаграмЭ,Бартошев ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС,(71) Ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и Ордена ТрудовогоКрасного Знамени московский государственный университет им.М.В.Ломоно-.сова и Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков(56). 1 И,Гвпрй,Н,К.РеЮ 1 х,Е.Чоп,Агх,Раз апй з 1 врФе вейЬод аког фЬе зерагай 1 оп оХ 1 пйегвеЖайез апй согассоге1 пчо 1 дед 1 п Юе Ьозупйпез 1 зо.Г серЬа)оерог 1 п С оз 1 пц сЬев 1 са ИуЬопдей С,)2 гечегзедрЬазе йЬп-Фауег,сЬгова 1 одгарЬу.1;сЬговайодг.,1931980, р.511-514,2. С.1.Вайд, А поче г Ойп ауегсЬговаХодгарМс зуз 1 ев апй 1 гваррИсай 1 оп йо Ие зерагай 1 оп оКвове серЬа 8 озрог 1 п сошроцпдз. 1.СЬгова 1 одг., 76, 1973, р.509-511(54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАМЕЩЕННЬЙ ЦЕФАЛОСПОРИНОВ путем хроматографирования анализируемого вещества.на анионооб" менной смоле, элюирования сиспользованием буферного раствора с по" следующим фотометрированием элюата, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности, точности способа и расширения области его применения, в качестве анионообменной смолы используют смолу с раэмером частиц 5"25 мкм, емкостью 3-5 мг-экв/г,в качестве элюента используют фосфатный или ацетатны буферный раствор с рН 5-8, содержа" щий 5-20 об. этанола, и элюирование ведут со скоростью 10-40 мл/ч.Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения. природных цефалоспоринов и их ядер - 7-аминоцефалоспорановых кислот, и может быть использовано в лабораториях микробиологической и медицинской промышленностях прк производстве Р-лактамных анти биотиков цефалоспоринового ряда.Цефалоспорин С и 7-аминоцефалоспорановые кислоты представляют собой 3,7-замешенные- а -цефем-карбо 3новые кислоты следующей структур" нойформулыФВ-юн - Сн-с;и снсо - Й с-сн;вСВСООКгде в случае цефалоспоринов ГВ,=СО(СН,), СН-.СООН.;БНР 2-Ососнз Он на в.случае 7-аминоцефалоспорановыхкислот12 бееИзвестен способ определения цефалоспоринов тонкослойной хроматогра- . фией на пластинах фирмы Апйес (Швей-) цария) с химически связанной фазой ОРТ 1 и РС. с последующим элюированием смесью воды с диоксаном, взятых н объемном соотношении 98:2 с последующей обработкой элюата нингидрином и его фотометрированием 11(,Недостатком способа является малая чувствительность и невозможность определения 7-аминоцефалоспора. новых кислот.Известен способ определения 7-ами. ноцефалоспорановых кислот тонкослойной хроматографией на пластинах Мегсй з 101 са ОеО Г 2 элюированием 0,5 М водным раствором хлористого натрия с последующим Фотометрированием элюата при 254 нм.Однако данный способ характеризуется невысокой точностью и невоз- можностью определения цефалоспори" нов С.Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемым результатам является способ количественного определения цефалоспоринов С путем жидкостной хроматографии на анионообменной смоле БАХ-ЕХРАХ Фирмы Ои роп 1 с частицами размером 25-37 мкм, емкостью 12 мкг-экв/г с последующим элюированием. боратным буферным раствором.с рН 9,6 при скорости элюирования 27 мл/ч при комнатной температуре с последующим спектрофотометрированиемэлюата при 254 нм ( 23,Недостатком способа является малая чувствительность (2 10 4 М), невысокая точность (близкие временаудерживания цефалоспорина С и дезацетилцефалоспорина С) и невозмож"ность определения 7-аминоцефалоспорановых кислот, т.е. ограниченяая область применения,10 Цель изобретенияповышение точности, чувствительности способа ирасширение области его применения.Йель достигается тем, что согласно способу количественного определе-15 ния замещенных цефалоспоринов путемхроматографирования анализируемоговещества на анионообменной смоле,элюирования с использованием буферного раствора с последующим фотомет 2 О рированием элюата в качестве анионообменной смолы используют смолу сразмером частиц 5-25 мкм,. емкостью3-5 мг-экв/л, в качестве элюентаиспользуют фосфатный или ацетатный5 бУФерный. раствор с рН 5-8, содержащий 5-20 об.Ъ этанола, и элюированиеведут со скоростью 10-4.0 мл/чПри работе со смолой, диаметрчастиц которой меньше 5 мкм, дляцостижения рабочей скорости элюацииЗО (10 мл/ч и более) требуется значительное увеличение давления в колонке.:что приводит к быстрой потере прони".цаемости колонки и сокращает срокее эксплуатации. Уменьшение,же скоЗ 5 рости элюации нежелательно, поскольку увеличивается продолжительность анализа (до 5 ч и более). Использование в качестве стационарной фазы частиц диаметром более40 25 мкм значительно ухудшает качество разделения.Применение анионообменной смолы семкостью меньшей чем 3 мг-экв/г эа"трудняет анализ многокомпонентных45 систем, вызывает необходимость разбавлять анализируемые пробы, чтосказывается на точности определения,Если емкость смолы более 5 мг-экв/г,то наблюдается сильная сорбция компонентов на носителе. Это . в своюочередь требует. элюента более кон"центрированного, чем 0,5 М.При использовании в качестве элю.ента растворов с концентрацией солименее 0,1 М происходит увеличениевремени.удерживания соединений наколонке, что удлиняет процесс разделения до,6 ч и более. Использование концентрации выше 0,5 М невоз-.можно из-за выпадения в осадок крис 6 О таллов соли в присутствии этанола.Применение элюентов с рН меньше 5нежелательно вследствие уменьшениясорбцки компонентов анализируемойсмеси. Проведение элюацик при рН65 больше 8 осложняет процесс анализаиз-за частичной деструкции определя.емых вещестн.Увеличение содержания этанолавыше 20 делает невозможным разделение цефалоспорина С и 7-амино-дезацетилцефалоспораноной кислоты, атакже приводит к набуханию частицсорбента и потере проницаемости колонки. Если концентрация этаноланиже 5, то отсутствует элюациякомпонентов сорбента.Проведение разделения.при малых.(менее 10 мл/ч) скоростях элюацииувеличинает продолжительность анализа и приводит к размыканию зонсорбции, что понижает чувстнитель"ность и точность метода. Элюирова"ние при скоростях потока более40 мл/ч ухудшает разрешение соедине."ний, имеющих небольшое различие времен удержания, а также приводитк спрессонанию частиц анионообменной смолы и делает колонку непроницаемой. Компоненты смеси (дезацетоксицефалоспорин С, дезацетилцефалоспорин С, цефалоспорин С, 7-амино- дезацетоксицефалоспорановую кислоту,7-амино-дезацетилцефалоспорановуюкислоту и 7-аминоцефалоспорановуюкислоту) детектируют по их поглоще-.нию при длине волны 254 нм, Идентификацию индивидуальных компонентовсмеси производят путем сравнениянеличин времени их удерживания на колонке с соответствующей характеристикой стандартных образцов. Количество (или концентрации) соедине.". ний в анализируемой смеси определяют путем построения соотнетстнунзцих калибровочных кривых.Для построения калибровочных кривых аликноты стандартных растворов индивидуальных веществ хроматографируют и определяют площади пиковна хроматограмме по формулеЯ = НИ2где Я - площадь пика;Н - высота пика;И-- ширина пика на половине вы 2соты.Величину калибровочного коэффициента в области линейности калибровочной кривой определяют по формулеЯК = - , где К - калибровочный коэффициенту с - концентрация компонента в М (или мг/мл).П р и м е р 1. 5 мкл раствора;содержащего смесь цефалоспорина С (ЦПС), дезацетилцефалоспорина С (ДАЦПС)., дезацетоксицефалоспорина С (ДОЦПС), 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК), 7-амино-дезацетилцефалоспорановой кислоты (7-АДАЦК) и 7-амино-дезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) наносят на коловку250 х 2,2 мм жидкостного хроматогра-фа фирмы Чаг 1 ап, термостатированнуюпри 50 С, с анионообменной смолойомарки Не 1 асЬе(Япония), имеющей емкость 3,2 мг-экв/г и размерычастиц 13,5+1,5 мкм, н Н РО 4 Формеи разделение осуществляют 0,25 Мраствором Н 4 Н 2 РО 4, РН 7,0, содержащим 10 этайола. Скорость потока10 20 мл/ч.Детектирование осуществляют в проточной кювете с объемом 8 мкл придлине волны 254 нм.Время удерживания, приготовлен 15 ные по навеске концентрации и определенные из хроматограмм концентрации (М) компонентов в смеси сведены в табл.1-6.Ошибка измерения +2. Точность2 О определения 98.П р и м е р 2. 5 мкл раствора,содержащего смесь ЦПС, ДАЦПС, ДОЦПС,7-АЦК, 7-АДАЦК и 7-АДЦК наносят натермостатированную при. 50 С колонку250 х 2,2 мм с анионообменной смолоймарки АвЫ 1 вех АОиорав (СШАемкостью 3,2 мг-экн/г и размерамичастиц 5+1 мкм, и разделение проводят 0,25 М растнором (МН 4)НРО РН8,0, содержащим 10 этанола прйскорости потока 40 мл/ч.Точность определения 98. Ошибкаизмерения + 2,П р и м е р 3. 5 мкл раствора,содержащего смесьшести компонентов,35 наносят на ксжонку с анионообменной смолой марки ДА-Х 8 (США) емкостью 3,2 мг-экв/г и размерами частиц25+2 мкм. Разделение проводят в ус,ловиях, описанных в примере 1, за4 О исключением того, что в. качествеподвижной фазы используется СН СООИНРН 5,0.3,4Ошибка измерения +4. Точностьопределения 96.45 П р и м е р,4. 5 мкл кулвтуральнойжидкости СЬерпа 1 озрог 1 цв асгевоп 1 цвс неизвестным содержанием цефалоспо"рина, предварительно отфильтрованнойот питательной среды и клеток, наносят на колонку с анионообменной смо 5 О лой марки 001)Х 1 к 8 .(ФРГ) с размерамичастиц 13,5 ф 1,5 мкм и емкостью5 мг-экн/г. Разделение проводят вусловиях, описанных н примере 1.П р и м е р 5. Образец в объеме55 5 мкл, приготовленный, как указанов примере 4, наносят на колонку саиионообменной смолой емкостью3,2 мг-экв/г.с размерами частиц13,5+1,5 мкм, и разделение проводят60 РаствоРом 0,1 М Н 4 Н 2 РО 4 РН 7,0,содержащим 50 этанола, в условиях,описанных в примере 1.П р и м е р 6. Образец в объеме5 мкл, приготовленный как указанов прймере 4, наносят на колонку с1048401 Таблица 4 цпс доцпс Длцпс Компоненты 10,6 8,3 6,2 2,9 10 4 4,95 10 ф 1,5108 Таблица 5 ДОЦПС ЦПС ДМПС Компоненты Время удерживания, мин 14,5 20,5 27 Таблица 6 ЦПС ДОЦПС ДАЦПС Компоненты Время удерживания, мин 2,6 2,1 1,5 5,10-4 3210 з 1,6 10 2 Из-за близких значений времен удерживания ошибкапри определении концентрации дезацетоксицефалоспорина ДОЦПС) может быть значительной 1 какследствие - 20 этаиола в элюенте. ВНИИПИ Заказ 7924/51 Тираж 873 Подписное Филиал ППП "Патентп,г.ужгород,ул.Проектная,4 Время удерживания, мин Коцентрация определенная, М Концентрация определенная, я Концентрация определенйая, М . 4,110 З 3,9 10 4 14,210