Способ получения водорастворимого иммобилизованного протеолитического комплекса

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИН 09) (11 41 зшОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ САНИЕ ИЗОБРЕТЕ АВТОРСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ Перкон Ю.Ю. К кевиц ты.нтоИздо во ССС(прототип),.(5 Й) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОГО ИММОБИЛИЗОВАННОГО ПРОТЕО" . ЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА, включающий растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического фермента, о т л,и ч а " ю щ и й с я тем, цто, с целью повышения активности иммобилизованного протеолитического комплекса и упрощения способа, в качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трис-оксиметиламинометановом буфере рН 8,05, а присоединение: фермента осуществляют при соотношении носитель;фермент 1:"3.1 1041Изобретение относится к получениювысокомолекулярных соединений, обладающих ферментативной активностью,находящих прйменение в химической,биохимической промышленности, а такжев медицине и для научных целей.Известны способы иммобилизациипротеолитических ферментов черезЙН-группы на носителях с альдегидными группировками 11.10Недостатки этих способов - снижение ферментативной активности послеиммобилизации, необходимость использования синтетических носителей илипредварительно активированных для 15получения альдегидных групп - природных носителей,Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения водорастворимого иимобилизованного протеолитического комплекса,включающий растворение содержащегоальдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение фермента 21.Согласно прототипу носителемслужат производные декстранов смол. массой 20-110 тысяч, окисленныедо степени окисления=6-483, а вкачестве фермента использован про"теолитический фермент террилитин.Взаимодействие декстрана с террилитином осуществляют в водном буферномрастворе при рН 7,5-10,0, температуре 15-25 С в течение 15- 180 мин присоотношении реагентов в реакционнойсмеси (декстран и фермент) от 1-0.1-0,9.Биокатализатор (стабилизированный декстраном террилитин) получают в двух последовательных стадиях:активация декстранов в реакции перио датного окисления степень окисленияматрицы=6-483), связывание фермента а окисленным декстраном.Этот процесс проводят следующимобразом. 165 мг декстрана, окисленного до степени окисления=2 Й,с мол. массой 20 тысяч и растворенного в 3,6 мл воды концентрацияполимера 50 мг/мл) смешивают с4,9 мл раствора фермента в 0,1 Мбооатном буфере рН 8,5, Реакционнуюсмесь перемешивают в течение 2 чпри 21 ф 1 С и рН 8,5, Затем добавля 0ют 1 мл О,1 И раствора боратногобуфера, содержащего 40 мг боргидри 567 2да натрия и перемешивают при 21 ф 1 фСв течение 40 мин.Полученный препарат, связанныйс Ферментом декстран, диализуютна холоде М 2 С) против дистиллированной воды в течение 48 ч. Послеэтого при помощи гельфильтрации отделяют избыток несвязанного фермента. Полученный препарат высушиваютлиофильно известным способом. Выход продукта 235 мг сухого препарата,Удельная активность 7,4 ПЕ/мг. Общаяактивность препарата 1740 ПБ.Выход продукта от введенной энзимат, активности 1.00,Недостатки известного способадефицитный и дорогостоящий носительдекстран, сравнительно низкая удель-ная и общая активность в процессе стабилизирования не увеличивается перво"начальная активность энзима), сложность процесса (длительный процессактивизирования матрицы, значительныезатраты времени, энергетических ресурсов и сырья), неоднородностьматрицы (мол. масса колеблется впределах 20-220 тысяч),Цель изобретения - повышение активности иммобилизованного протеолитического комплекса и упрощение способа.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу получения водораствориыого иммобилизованного протеолитического комплекса,включающему растворение содержащегоальдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического фермента, вкачестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трис"-оксиметиламинометановом буферерН 8,05, а присоединение Ферментаосуществляют при соотношении носитель:фермент 1:1-3,В предлагаемом способе в качестве матрицы используют качественно новый носитель-ксилоуронид, изолированный из лигнифицированного растительного материала, например древесины, отхо" дов сельскохозяйственной и деревообрабатывающей промышленности. Ксилоуронид образуется в больших количест" вах в процессе сульфатной варки целлюлозы из лингифицированного растительного материала как побочный продукт, а также может быть получен и прямой экстракцией холоцеллюлозы, разбавлен3 1041ной щелочью. Положительным факторомявляется однородность ксилоуронида,мол. масса последнего колеблетсяв пределах 16-13 тысяч.Матрица характеризуется следующими показателями:Степень полинеризации(Сп) 110130Мол. масса, Дальтон 16000-18000Количество активных Оальдегидных групп,мгЕг препаратаТаким образом, в качестве носите"ля используют дешевый и доступный . 15ксилоуронид,Процесс присоединения фермента кносителю происходит при взаимодействии карбонильных групп полимераматрицы) и аминогрупп остатков лизи" 2 Она фермента. Схематически реакциюиммобилизации можно изобразить в следующем виде;ф ТРИС. рН 8-9; Х-ФК-С . +ф-ИНК-С "Н 218-20 ОС Нгде К " ксилоуронид;ф ." Фермент.Реакцию проводят в мягких условиях при 18-20 ОС и в 0,1 И трис-оксииетиламинометановом буферном растворерН 8,65, так как оптимум действияферментного комплекса расположенпри указанном значении рН.Согласно способу получения водорастворимого стабилизированного пре"парата протеолитического ферментногокомплекса осуществляют ковалентноесвязывание полимера с ферментом присоотношении носитель;Фермент 1:1-3: 4 ОПри этом колицество.взятого энзимапревосходит количество матрицы. Множество активных альдегидных,группносителя при низких концентрацияхфермента может реагировать не только с реакционно способными группамина поверхности ферментного комплекса,но и с татовыми в активным центрахфермента. Когда же фермента много,альдегидные группы матрицы преимущественно реагируют с аминными группами на поверхности ферментного комплекса, не затрагивая активных .центров фермента, благодаря этому обеспечивается высокая активность пре 55парата. Учитывая, что процесс иммобилизации стабилизации) фермента осуще 567 4ствляется при рН 8,05, а дальнейшее использование стабилизированного фермента происходит при рН 8, азоме"ц тиновая связь как при хранении биокатализатора, так и при работе.Способ осуществляют следующим образом.Ксилоуронид растворяют в 0,1 М трис-оксиметиламино метановом буферном растворе, рН 8,05 в течение 10 о 15 мин при перемешивании при 18-20 С . Растворймый комплекс полимеро-фермент, например протеолитическйй ферментный комплекс, получают добавлением фермента к раствору ксилоуронида при соотношении носитель;Фер- мент 1:1-3 с последующим перемешиванием в течение 5-10 мин и выдержкойгсмесипри 18-20 ОСв течение 24 ч.Полученный предложенным способом водорастворимый комплекс фермента-полимера через 24 ч обладает активностью 140, 5-460,03 от исходной активности, а через 30 сут остаточная активность 107,1-347,63 от исходной активности,В таблице показано стабилизирующее действие ксилоуронида. Активность фермента, 3 Время Иммобилизованный,1 О 2 ч 1019 102,7 15 сут 30 сут 0 110 120 П р и м е р 1. 0,05 г ксилоурони-, да .растворяют в 12 мл 0,1 М трис-оксиметиламинометановом буферном растворе рН 8,05.Растворяют на магнитной мешалке 15 мин при 20 С.К раствору ксилоуронида добавляют 0,05 г протеолитического ферментного комплекса, полученного изАзрегц 11 цз агца 1 КС. соотношение носителя и фермента 1:1) смесь перемешивают в течение 10 мино и выдерживают сутки при 20 С. Стабилио зированный препарат хранят при 0-4 С.че ез 30 су; 14763 9 мкМоль тирозинаг белка минт.е. 347,63 от исходной,П р и м е р 3, 0,05 г ксилоуронида растворяют в 12 мл 0,1 М трис"оксиметиламиновом буферном растворе, рН 8,05Растворяют на магнитной ме-шалке 12 мин при комнатной температуре. К раствору добавляют 0,15 г протеолитического ферментного комплекса, полученного из Азрегд 111 цз агуга 1 КС (соотношения носителя и Фермента 1:3) Выдерживают 24 ц при 20 С. Хранят0О стабилизированный препарат при +4 С. Активность через 24 ц 13689,4мкМоль тирозина 322 30г белка минисходной через 30 сут 14343,4мкМоль тирозинаг белка минходной. Использование изобретения обеспе" чивает увеличение активности биокатализатора в 2-4 раза по сравнению с прототипом и сохранение ее без существенных изменений в течение 30 сут (см. таблицу), упрощение процесса - исключается стадия активации матрицы. Кроме того, сокращается время иммобилизации и достигается экономия электроэнергии и материалов,Ф 1041567Активность через 24 ч 59675 мкиоль тиРозина т е 140 5 Ф от исходной, через 5 М ф 9 г белка мин5 т.е. 107,1 от исходной.Активность иммобилизованного протеолитического ферментного комплекса Определяется по модифицированному методу Ансона. 10За единицу протеолитической активности иммобилизованного протеолити" ческого комплекса принято ткое количество связанного препарата, кото" рое за минуту при температуре 37 С и0 РН 8,0 катализирует превращейие суб-. страта (казеина) в неосаждаемое с ТХУ 1,три"хлоруксусной кислотой) состояние, содержащее один микро- моль тирозина. 20П р и м е р 2. 0,05 г ксилоуронида растворяют в 12 мл 0,1 М трис-оксиметиламинометановом буферном растворе рН 8,05. Растворяют йа магнитной мешалке 10 мин при 18 С. К рас"25- а твору ксилоуронида добавляют 0,125 г "пРотеолитического ферментногЬкомплек"са, полученного из Аврегц 111 цз агуаа 1 КС соотношение носителя и , фермента 1:2,5), Выдерживают 24 чпри 180 С, Хранят 0 стабилизированный препарат при +4 С.Активность через 24 часа 195380 МКМоль ти озина е 460 исхо ой г 6 елкамингоставитель И.ПриваловаРедактор В, Ковтун Техреду А.Бабине КорректорС.ШекмарЗаказ 7065/24 Тираж 523 ПодпйсноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1 ЦОЯ Москва Ж-Ц Раушская наб., 9, 4/филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4