Способ определения витаминов группы е

(54) СПОСО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНО РУППЫ Е Изобретение относится к химическимНаиболее близким к предлагаемому по методам определения витаминов группы Е технической сущности и достигаемому ре (токоферолов) с применением хроматогрв- зультату является способ определения вифических методов очистки, в частности тамина Е в биологическом объекте, заклю тонкослойной хроматографии (ТХС) и мо- чающийся в том, что нввеску материала5жет быть использовано приопределенииомьпппот спиртовым раствором щелочи, содержания токоферолов в кормах, пище- экстрагируют неомыляемые липиныэфиром вых продуктах, в органах и тканях живот . и отмывают дистиллированной водой до. ных (напрнмер, для контроля их Е-вита- нейтральной реакции, высушивают эфирный минного кормления) в медицинских, вете ф экстракт сульфатом натрия, упаривают его, ринарных и других биологических иссле- растворяют в малом объеме растворителя дованиях, а также для контроля произво- и наносит на специально приготовленные ства витамина Е. хроматографические пластинки с незвкрепИзвестен способ определения витвми- ленным слоем, обнаруживают токоферолы нов группы Е в биологическом матерна при ультрафиолетовом облучении по свнле,.включающий экстракцию общих лици- детелю, снимают с пластинки слой адсордовнзтканиорганнческнмнрастворителями, бента и щпоируют витамин Е рвстворите-, выделениеи очнсткутокофероламетодом лем, упаривают раствор витамина, раство тонкослойной хроматографии,окислениеего ряют остаток в спирте, производят ивет потокоферилхннонв и спектрофотометрн- "0 ную реакцию и фотометрируют полученный ческое определение послепнего 11. раствор, Концентрацию витамина Е опреНедостатком способа является его от- дежпот по предварительно построеннойконосительно невысокая чувствительность, лнбровочной кривой2.3 9742Недостатками известного способа являются длительность анализа, низкая точность н чувствительность.Цель изобретения - сокращение длительности анализа, а также повышение точности и чувствительности способа.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения витаминов группы Е путем омыления анализируемой пробы в присутствии "пирогаллола в 10 атмосфере азота при 90-95 фС, экстракцни эфиром неомыляемой части пробы, высушивания эфирного экстракта, выпаривания и растворения полученного остатка в хлороформе, с последующим тонкослой ным хроматографическим разделением полученного раствора путем нанесения его на хроматографическую пластинку, после чего пластинку с хлороформным раствором обрабатывают цветореагентом - смесью р 0с(,-о/ -дипиридила и хлорного железа с последующим элюированием окрашенного адсорбированного слоя смесью содержащей этанол, соляную кислоту, фосфорную, кислоту и бидистиллированную воду, при 2 В следующем соотношении компонентов, об.ЪЭтанол 45 - 55Соляная кислота 20 - 30Фосфорная кислота 6-10Бидис тилированная 30вода 5- 29 и фотометрированием элюента.Предлагаемый. способ позволяет селективно определять изомеры витаминов группы Е ( токоферолов), причем локализацию токоферолов е -изомера определяют по свидетелю, а+ Д нэомеров - по величине КуП р и м е р, Определение витамина Е в печени индюков.Наьеску гомогената печени (3-5 г) переносят в колбочку для омыления, добавляют 50 мл этанола, 100 мг яирогаллола, 5 мл 60%-ного раствора гидроксида .калия, присоединяют обратный холодильник, продувают азот 6 7 мин и омыляют на глицериновой бане 20 мин при 90 95 фС. Затем охлаждают и трижды экстрагируют неомыляемую фракцию эфиром пор днями по 40 мл. Затем эфврный экстракт отмывают до нейтральной реакции дйстилли. рованной водой по бромтимоловому синему, высушивают безводным сульфатом натрия и выпаривают в токе азота на роторном испарителе. Далее сухой остаток растворяют в 01 - 0,2 мл хлороформа и микроЯ шприцем Iнаыосят 0,08 0,1 мл раствора на стартовую линию хроматографической пластийки в вире полосы длиною 20 62 ф30 мм Рядом наносят свидетель-пример.но 3-5 мкг о =токоферола,Хрома тографическое разделение токоферолов на подготовленных пластинкахосуществляют в камере, насыщенной,парами хлороформа, через которую в течение 15 мин продувают азот. Когда фронтрастворителя приближается к верхнемукраю пластинки, необходимо извлечь ееиз камеры и высушить в токе азота при38- 40 фС. Затем обильно опрыскиваютпластинку свежеприготовленным проявляющим раствором, состоящим из равныхобъемов 0,5%-ного раствора (., ос-дипиридила и 0,2%-ного раствора хлорногожелеза и этаноле,Обработанную пластинку выдерживаютв горизонтальном положении 5 - 7 мин,чтобы проявляющий раствор впитался адсорбентом и количественно прореагировалс витамином Е с образованием роэовокрасного пятна. Затем подсушивают пласфтинку в инертной атмосфере при 20-25 Сопределяют локализацию р -токоферола посвидетелю и количественно переноситокрашенный участок адсорбента в пробирку с притертой пробкой,Затем в пробирку приливают 3 мл; элюирующей смеси, состоящей иэ этанола,соляной и фосфорной кислот и бидистиллата в объемных соотношениях 6: 3: 1: 2,энергично встряхивают 15 - 20 с и фильм.руют через обеззоленный фильтр (краснаялента). Сполоснув пробирку 1 мл этой жесмеси, переносят ее на тот же фильтр.Полученный розовый фильтрат фотометридчот при М830 нм, по сравнению сэлюирующей смесью. Содержание витамина Е вычисляют по формуле Ч ЭчгдеЕ - содержание оС-токоферола в ткани, мкг/г;- объем хлороформа, в которомрастворена проба, мл;Ч - объем хлороформенного раствора,нанесенного на пластинку, мл;т - навеска субстрата, г;- количество (, -токоферола по калибровочному графоку.П р и м е р 2. Определение иэомеров токоферола в травяной муке..Навеску травяной муки (1-2 г) переносят в копбочку с притертой пробкой, заливают 100 мл эфира и,ж.тряхивают иа шюттель аппарате 20 миь Затем филь руют и упаривают эфир в атмосфере азота иа роторном исцарителе. Сухой остаток-60 6,7 Извесный 4,6+О 59 14-4 блица 2 Содержание компонентов в смеси, об.% Компоне 40 42 48 50 25 28 28 28 55 5 28 2 8 8 12 9 танол 5 Соляная кислота фосфорная кисло Бидис тиллат 8 8 22 22 Определение, -тоферола, % 0 3 8 98 9 100 9 80 50 80 17 20 25 ЭтанолСоляная кислота 50 530 33 50 35 8 8 8 фосфорная кислотБидистиллат.10 1 7 18 1 Этанол Соляная кислота фосфорная кисло 23 2 стилла 00 9 ток репе,6 90,1 а,5 97426 растворяют в 0,05 - 0,1 мл хлороформа и микрошприцом наносят 0,025 - 0,05 мл этого раствора на стартовую линию хрома. тографической пластинки (пластинку не нагревать) в виде полосы, длиною 40 - ф 80 мм, Рядом наносят свидетель, содержащий примерно 3- 5 мкг ос -токоферола. Процедуры хроматографирования, опрыскивания и подсушивания пластинки такие же, как и при определении витамина Е в пе чени, определяют локализацию токоферолов сС-изомерК по свидетелю, а /3 +-по величине КуВсе дальнейшие процедуры такие же, как и определение витамина " в примере 1, При отсутствии специальных 1 свидетелей допустимо определение концент. рации изомеров по калибровочному графи ку построенному по с -токоферолу. Ка пластинках "Силуфол" разделяется 3-40 мкг витамина Е. Если интенсивность окраски пятна мала, цветной комплекс элюируют из нескольких пластинок. При элюировании пятен спирто-водным раствором кислот расхождения между параллелями не превышают 1% и окраска элюита устойчива 15-20 мин.Сравнительные данные определения с(;токоферола в желтке индюшиных яиц приведены в табл. 1.В табл. 2 приведено определение допустимых пределов состава вещества.Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить время анализа. Вследствие его большей точности, чувствительности и селективности по сравнению с%,известным способом удобно его исполь- . зование для определения изомеров токо феролов в травиной муке, витаминная ценность которой определяется не сумь 3 ой изомеров, а содержанием только с.-токоферола, что позволяет более рационально использовать Е-витаминные корма.1 Т а б л и ц а 17 974ф орм ула изобретения Источники ияфармапаи,лринятые во внимание при экспертизе1. Кейфах Е. А., Буробина С. А,1 з Количественный метод определения токоферола и его производных в тканях животных. - "Вопросы медицинской химии.1967, т.ХЩ М 1, с, 94 - 97.2. Крюков.В. С., Дмитровский А. А.ф и др. Определение витаминов А. Е и каротиноидов в кормах препаратах и биологических объектах, Методические рекомендации ВНИТПП, Загорск,1978, с. 3-23,СоставительРедактор Н. Кнштулинед Техред М.Тенер Корректор И. Ватрушкииа аказ 8686/6 1 Тираж 887 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж-йб, Раушская набд, 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Способ определения витаминов группы Е путем омыления анализируемой пробы, экстракйии эфиром неомыляемой час" ти пробы, высушиваиия эфирного экстракта, выпаривания и растворения полученного остатка в хлороформе с последующим тонкослойным хроматографическим разделением полученного раствора путем нане сепия его иа хромвтографическую пластинку с использованием элюироввния вд,. сорбированного 1 слой, обработки цветореагентом и фотометрирования элюента,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с пвлью сокращения длительности анализа повышения точности и чувствительности способа, омыление ведут в присутствии пирогаллола в атмосфере азота при 90 95 С и пластинку с хлороформным раствором обрабатывают цветореагентом,смесью а- с -дипиридила и хлорного железа с последующим элюированием окрашенного вдсорбированного слоя сме 262 8сью, содержащей этанол, соляную кислоту, фосфорную кислоту и бидистиллирован-"ную воду, при следующем соотношениикомпонентов, об. %:Этанол 45 - 58Соляная кислота 20- 30фосфорная кислота 6 - 10Бидистиллироваинаявода5-29и фотомезрироввнием элюента.