Способ получения претромбина 1

(23) ПриоритетОпубликовано 15. 11 Веудвратюкыа кенит 1 Сь.Р ао двлаи взабретаиив и открытка2, БюллетеньУДК 612.115.12(088.8) ата опубликования описания 17. 1 Г ошина и Б.А. Кдряйв:-;".", 7 вторыбретени ова, Т,Н,осковскии ордена Ленина, ордена и ордена Трудового Красного Знауниверситет им. М.В. Лом 71) Заявитель) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕТРОМБИНА 1 к медицине я диагностиывающей сисии ее йункзаболеваний гих систем, ми явленияавленная цель достигается тем, ласно способу получения преа 1 путем осаждения протромбикомплекса из плазмы крови, гид го тромбином, с последующей рафической очисткой гидропиэа олиэ протроибинового комплеке ляют в среде, содержащейнтетраацетат натрия и фер, хроматографическую очистлизата осуществляют на сорб ин-сефароза и элюируют целект в линейном градиенте хпория с концентрацией 0,05-1,5 цетатном буфере при рН 6,0- нцентрации хлорида кальция ммоль. Постчто согтромбинновогоролизахроматота, гидса осущэтилендтрис"буку гидрте гепарвой продурида натв трис-а6,2 н ко2,1-2,6 ств ами ми.Известе бина 1 пут го комплек претром- омбиново- гидроющей хро- ролизаполучени ения прот азмы кров с послед исткой ги по осаж ен мбино кой о лиза его тматографичта 1 1 . Однако изввает низкий в20-25,) и, ктелен и трудои не позволяеный продукт. ие тныи способ од целевогоме того, спо мок ( требуетполучить выс про соб биновыиием его иэ рия, поспедуванием сульическими и е р 1. Протр с получают осажде быка на цитрате б люцией, Фракционир аммония и изоэлект нием. комплеко плазиы очищене Цель иэобда и чисто ато саж ия - увеличение вылевого продукта. Изобретение относится и может быть применено д ки состояния противосвер темы, а также для актива ции с целью профилактики сердечно-сосудистой и др осложненных тромботйческ3 . 9731Берут 20 мг протромбинового комплекса ( 2000 И 1 Н ед, на 1 мг белка) и инкубируют с 30 ч 1 Н ед, тромбина ( 2000 й 1 Н ед. налг белка) в 0,05 М трис-НГ 1 буфере, рН 7,4, содержащем 5 1 ммоль ЭЛТА-натриевой соли 15 мин при 37 О С (соотношение фермента и субстрата по единицам активности 1:1300) . Р акционную смесь диализуют против 0,02 М трис-ацетатного буфера, О рН 6,0, содержацего Р,Р 5 М йаС 15 ч.4 атен в диализат добавляют 0,4 М раствор ГаС 1 до конечной концентрации 2,5 ммоль и наносят в объеме 6 мл на колонку с гепарин-,сефарозой.( 1 х 40 см) 5 уравновешенную 0,02 ммоль трис-ацетат ным буфером, рН 6,0, содержащим 005 И МаС 1 и 2,5 ммоль СаС 1. Первую элюцию проводят тем же буферомобъеме 60 мл. Затеи проводят гра диентную элюцию, используя для создания линейного градиента ионной силы следующие растворы: 100 мл 0,02 И трис-ацетатного буера, рН 6,0, содержащего 0,05 М йаС и 2,5 мМ СаС , 25 и 100 мл того же буфера, содержащего 1,5 М ЯаС 1. В,элюируемых фракциях анализируют .содержание белка и свертывающую активность. Со свободным объемом колонки выходят несвязавшие о ся белки ( 203 ), среди которых обнаруживают фрагмент 1 протромбина с молекулярной .массой 25000, отщепляемый от молекулы протромбина тромбином в процессе гидролиза. Градиентной элюцией получают три белковых компонента. Первый компонент, содержащий 703 нанесенного белка, элюируется 0,45 М 1 аС 1. Молекулярная масса компонента определена равной 60000. Компонент идентифицирован как претромбйн 1. При концентрации ИаС 1 0,64 И элюируют второй компонент, содержащий 5 Ф нанесенного белка с молекулярной массой 50000, не проявляющий характерных 4 свойств претромбина 1 и тромбина и идентиФицированный как фактор Х. При увеличении концентрации ЦаС 1 до 0,9 М элюируется третий компонент содержаий следовые количества тромбинаО, Ц 1 Н ед. на 1 мл элюата/,Из 20 мг тромбинового гидролизата протромбина получают 14 мг претром- бима 1, гомогенного при электрофоре- ЗЕ В ГЕЛЕ ПОЛИаКрИЛаМИда, С МОЛЕКуЛяр.55 ной лассой 60000, не обладающего фибриноген-свертывающей, эстеразной, фибринолитической и протромбиновой ак 29 4тивностями. Претромбин 1 медленно (втечение часа) генерирует тромбин( 80+2 ед/мг в присутствии фактораХ /2 ед/мг). Полученные препарыты пре"тромбина 1 проявляют высокую физиологическую активность, возбуждаяфункцию противосвертывающей системыпри внутривенном введении крысам вконцентрации 0,5 мг/кг веса тела.В табл. 1 показано изменение биохимических показателей состояния противосвертывающей системы после внутривенного введения претромбина 1с 0,5 мг/кг веса) .. Таким образом, претромбин 1, введенный внутривенно крысам в концентрации 0,5 мг/кг веса, уже на 1-ой минопыта вызывает статистически достоверное увеличение суммарной фибринолитической активности ( СЙА) на 363и неферментативного фибринолиза ( Нф),отражающего уровень комплексных соединений гепарина с белками крови ибиогенными аминами, на 413. Выброс,гепарина в кровоток является важнейцим этапом эффекторной реакции противосвертывающей системы,Таким образом претромбин 1, привнутривенном введении крысам в низкойдозе 0,5 мг/кг веса активирует функцию противосвертывающей системы, чтоговорит о хорошем качестве препарата.П р и м е р 2. Протромбиновый комплекс получают как в примере 1. Затемберут 30 мг протромбинового комплекса ( 2000 М 1 Н ед.,на 1 мг белка) иинкубируют с 30 Й 1 Н ед. (2000 М 1 Н ед,на 1 мг белка) тромбина в 0,05 М трисНС 1 буфере, рН 7,4, содержащем1 млопь ЭДТА-натрйевой соли, 20 минпри 37 О С, Соотношение фермента и субстрата по единицам активности 1:2000Последующие операции проводят как впримере 1. Получают 21 мг претромбина 1, гомогенного при электрофорезев геле полиакриламида, с молекулярноймассой 63000, не обладающего фибриноген-свертывающей, эстеразной ( по ТАМЭи БАИЭ), фибринолитической й протромбиновой активностью, Претромбин 1генерирует тромбин (90+10 ед./мг) втечение часа в присутствии фактораХО (2 ед./мг), Препарат претромбина 1проявляет высокую физиологическую активность при анализе методом перфузиигуморально изолированного, но с сохраненными нервными связями с организмом каротидного синуса кролика. Втабл, 2 показано изменение биохимичес129 6ствуя с хеморецепторами только одной из рецепторных зон противосвертывающей системы, в очень малых концентрациях ( 0,07 мг/мл) вызывает рефлекторный ответ этой системы, создающий вы сокий антикоагулянтный и фибринолитический фон и предотвращающий угрозу тромбообраэования при провокации тромбиногенеза,973 Предлагаемый спосоо позволяет по- . лучить целевой продукт эа 10-12 ч против 29-33 ч известным способом. Выход претромбина составляет 65-753 по сравнению .с известным 20-253. Претромбин 1, полученный предлагаемым способом, свободен от примеси диизопропилфторфосфат-тромбинв, который обладает физиологической активностью. Таблица Суммарная фибринолитицескаяактивность, мм Условия опыта Статистическиепоказатели Время после введения, мин 45,В 2,6 48,82,0 58,8+2,1 56,8+ ,7 Контроль0,85".: МаС Опыт 64,2+3,1 72,64,2 83,0+7,8 77 "3 9 И+и Претромбин 1 И р 0,001 сО,О с 0,02 с 0,001 Таблица 2 Неферментативный фибринолиэ, ФВремя рекальцификацииплазмы, Ф Время после перфузии,мин Ъ136,2+10,7 (6)с 0,01134,6+11,2 (6) ф182,ОЙ 3)2 (6)0,001161,8 Ы 9,0 (6)с 0,01 131,215,8 (6) с 0,001132,0+ 9 0 (6) с 0,01 Пи/и / Иф и/и / 10 с 0,02 ких показателей состояния противосвертывающей системы после перфуэии каротидного син уса кролика претром- бином 1 ( 0,07 мг/мл в объеме 20 мл).Таким образом,при перфуэии претромбином.1, полученным в примере 2 . изолированного каротидного синуса. кролика происходит активация противосвертываоцей системы, характеризующаяся статистически достоверным уве- О лицением к 5-ой иин опыта времени рекальцификации плазмы на 314, суммарной фибринолитицеской активности на,363, неферментативного фибринолиза - на 82;. Высокий антикоагулянтный 15 фон, создаваемый комплексными соединениями гепарина, сохраняется на 1 О-ой мин опыта.Изложенные данные свидетельствуют . о тои, цто претромбин 1, взаимодей" 26 Статисти- Суммарная фибриноческие литицеская активпоказате- ность,ли Неферментативный фибринолиз, мм 2. Время после введения,минюте т атее атав т а та а атетиваиви таатаетатеввитеиетее теиаиветт П р и м е ч а н и е. За 100 принят исходный Фон при перфузии раствором РингератЛокка.Формула изобретения Составитель С. Малютина Редактор Т. Митрович Техрев Т,йаточка Корректор В, Прохненко Заказ 8565/5 Тираж 714 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва, 3-35 Раушская наб. д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, Способ получения претромбина 1 путем осаждения протромбинового комплек. св иэ валаамы крови, гидролиэа его20 тромбином с последующей хроматографической очисткой гидролизата, о тл и ч а ю"щЙЙ с я тем, что, с целью увеличения выхода и чистоты целевого продукта, гидролиз протромбинового комплекса осуществляют в среде, содержащей этилендиаминтетраацетат натрия и трис-боер, хроматографическую очистку гидролизата осуществляют на сорбенте гепаринесефарозаи элюируют целевой продукт в линейном градиенте хлорида натрия с концентрацией 0,05 т 1,5 М в тристацетаттном буфере при рН 6,0 т 6,2 и концентрации хлорида кальция 2,4 т 2,6 ммоль.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Не 1 деЬгапС С.М., ВцОсоиэс Й.1.,ВаДа) Я.Р Мапп КА. ТЬе ассчасопот ргойЬговЬи. " "1. Во 1. СИещ.,"1973, ч. 248, р 7149 т 763.