Способ определения теофиллина в сыворотке крови

СОЮЗ СОВЕТСНИСОЩЕЛИСТИЧнжРЕСПУБЛИК А 1 р 1)Ю С 01 И 33/ НОМИТЕТОТНРЫТИЯ)1 ГОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯПРИ ПНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ К АВТОРСКОМУ ДЕТЕЛЬСТ 47/28-14.8790, Бюл. Уюэный научитут "Биотех 23 исследовате нология .Данило асилов, Н,ан15 (088. 8) ект фирмы мныи дсз. НА 54)СЫВ57) еле- идкосдля лехимии коловна ф ния ттях,карст и к области способу о огических бретение относитс СН - 1 Ч ммунохимии, конкретноения теофиллина в би костях, и может быть д спользовано 1си,он- оль(бычий сыворот Этот антиге бумин) .ет получит ал п во ти тела онстанта связывания О л/моль. По специфи ела близки к антитела звестном способе. ти эти антиписанным в вст" выИз антияют иммуят их п еофиллин но гл обули роксидаэ рбции на вых сыворот коньюс бел новые фракции ий известным метотвердой Фазе опроьюгированных андом. Для с бованы нес ько ко(21) 43406 (22) 22. 12 (46) 23,06 (7 1) Всесо ский инсти (72) Р.Г.В и Н.И.Бекм (53) 612.0 (56) Рекла А 11 егдепеГ ПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕОФИЛЛИРОТКЕ КРОВИзобретение относится к иммуконкретно к способу опреофиллина в биологическихможет быть использованоенного мониторинга при те для лекарственного мониторинга пртерапии теофиллином: контроль зацентрацией препарата в организменых, подбор индивидуальных доз длвышения эффективности терапии и уранения токсических явлений.Цель изобретения - повышение чвительности и ускорение способа.Способ осуществляется следующимобразом.Для иммунизации используютгированный антиген теофиллинаком, имеющий следующую структуру:(тео-аэо-БСА) теофиллином: контроль за концентрацией препарата в организме больньж подбор индивидуальных доз для повышения эффективности терапии и устранения токсических явлений. Целью изобретения является повышение чувствительнос ти и ускорения способа. Измерение тес филлина в сыворотке крови основано на конкуренции между теофиллином из пробы и теофиллином, связанным с твер дой фазой аэо-связью с антителами к теофиллину, меченными пероксидазой. Для анализа необходимо несколько мкл сыворотки или плазмы крови (достаточно капли крови из пальца), длительсть анализа 30 проб составляет о 40 мин, чувствительность метода ра 0,01 мкг/мп теофиллина. 1 табл.1573427 40 тигенов теофиллина и дпя использованияв методе определения теофиллина выбран коньюгат, позволяющий достичьмаксимальной чувствительности.5При иммунизации коньюгированнымантигеном всегда образуется три типаантител: на носитель, на гаптен и насвязь между гаптеном и белком. Присорбции на твердой Фазе того же конью Гата, который был использован дпя имМуниэации, связываются все три типаантител, полного ингибирования связы"вания антител с антигеном свободнымпрепаратом добиться не удается, из-за 15чего чувствительностьметода оказывается невысокой. В предлагаемом способе онаравна 0,5-1 мкг/мл. Для устранениявлияния антител к носителю был синтезирова.н коньюгированный антиген, отМичднющйся от использованного дляИммунизации белком-носителем;О(человеческий сывороточный альбумин),30При использовании такого коньюгатадля сорбции на твердой Фазе чувстви"тельность метода возросла до0,1 мкг/мл,Следующим этапом работы был синтезконьюгатов, отличающихся от использо - 35ванного для иммунизации не толькоантигенным носителем, но и типом химической связи между гаптеном и белком.Эти коньюгаты имели следующиеструктуры:(человеческий сывороточный альбумин) .Использование второго и третьего коньюгированных антигенов не приводит к существенному повышению чувствительности определения теофиллина, в то время как использование первого коньюгата повышает чувствительность метода до 0,01 мкг/мл.Для проведения анализа коньюгированный антиген тео-г/а-ЧСА сорбируют на твердой Фазе (полистироловые 9 б-луночные планшеты, пробирки, шарики) в концентрациях, достаточных для насыщения твердой фазы (они подбирались экспериментально), Аликвоты по 1-10 мкл из сывороток крови больных, получавших теофиллин, контрольных донорскихсывороток или донорских сывороток с внесенным в них известным количеством теофиллина смешивают с разведенными антителами к теофиллину, мечеными пероксидаэой, и инкубировали 20 мин с сорбированным на твердой Фазе анти- геном, Количество антител, связавшихся с антигеном, оценивают по активности Ферментной метки по сравнению с контролем. Активность пероксидазы можно измерить с помощью любого доступного субстрата, дающего после реакции с Ферментом окрашенный продукт (ортофенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота, о-дианизидин и др.).Разведение антител подбирают предварительно таким образом, чтобы в контрольном опыте (донорские сыворотки без теофиллина) получить значения поглощения, равные 1-1,3,П р и м е р 1. Получение коньюгиро " ванного антигена теофиллина с бычьим сывороточным альбумином (Т"азо-БСА) ..К 20 мг 8-аминотеофиллина в 10 мкл муравьиной кислоты и 100 мкл 1 н.НС 1о добавляют 6 мг ИаЮ при О С. Через 20 мин образовавшуюся диазониевую соль 8-аминотеофиллинапо каплям добавляют к охлажденному раствору 100 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) в1 мп 0,15 М Фосфатного буфера, рН 8,2. Величину рН поддерживают равной 8-9 добавлением 1 .н. ИаОН, После 2-часового перемешивания при 0-10 С смесьСпецифичность антител, % к теофиллину Вещество 10030,1 0,1 О,01 0,01 0,01 0,01 0,01 ТеофиллинКоФеинТеобромин3-ГетилксантинМочевая кислотаКсантинГипоксантинГуанинФенобарбитал 5 15734 делят на колонке с сефадексом Сили диализуют против воды до тех пор, пока поглощение в диализате при 290 нм не становится меньше 0,05. Белковую Фракцию лиофильно высушивают. Содержание теофиллина в полученном коньюгированном антигенео определяют по разнице между УФ-спектрами коньюгата и БСА, исходя из Е О, , =87 для 10Л 08-аминотеофиллина, тогда при Е ц - поглощении коньюгата в концентрации 1 мг/мл и поглощение исходного белка при той же концентрации, равном 0,3, и мол. м. белка и 8-аминотеофиллина, равных соответственно 69000 и 200, получают замещение в молях теофиллина на моль белка:69000Замещение = --- . --- 2 О87200- - -1Е,-О,ЗПолученный коньюгат содержит 13 молекул теофиллина на каждую молекулу белка. 25П р и м е р 2, Получение коньюгированного антигена теофиллина с человеческим сывороточным альбумином (Т-г/а-ЧСА).К раствору 40 мг 8-аминотеофиллина 30 и 90 мг человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и 2 мл 0,0.1 н, МаОН, охлажденного до 10 С, добавляют в течение 30 мин 120 мкл 25%-ного глутароного альдегида.Реакционную смесь пере 35 мешивают 1 ч и прикапывают 10 мгЯаВН в 100 мкл воды. После инкубации в те-. чение 1 ч при комнатной температуре белок отделяют от ниэкомолекулярных продуктов реакции в соответствии с щ примером 1. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре белок отделяют от низкомолекулярных продуктов реакции в соответствии с примером 1. Полученный коньюгат лиофильно высушивают. По данным УФ-спектров в нем с одной молекулой белка связано 15 молекул теофиллина.П р и м е р 3. Иммунизация животных и получение сывороток. 50Беспородных серых кроликов иммуниэируют коньюгированным антигеном Т-азо-БСА, 0,5 мг на,животное, коньюгат растворяют в 0,25 мп физиологического раствора и смешивают с 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда до образования устойчивой эмульсии. Смесь вво, дят подкожно в шесть мест на спине кролика, Иммунизацию повторяют через 27 66 недель и дале с интервалом 2-4 недели с неполным адьювантом Фрейнда. Кровь берут через 7 дн. после иммунизации из ушной краевой вены кролика, инкубируют 30 мин в термостате при 37 С, центрифугируют при 3000 об./мин 30 мин. Полученную сыворотку хранят замороженной при -20 С. Специфичность антител к .теофиллину определяют радиоиммунологическим методом по связыванию с Н-теофиллином и твердо 3Фазным иммуноферментным методом. Специфичность антител к теофиллину, перекрестные реакции в процентах к теоФиллину приведена в таблице. 1П р и м е р 4. Получение коньюгата иммуноглобулиновой Фракции сыворотки с пероксидазой (18-РО). Иммуноглобулиновую Фракцию получают из антитеофиллиновой сыворотки высаливанием сульфатом аммония 50%-ного насыщения. Пероксидазу из хрена, 4 мг, растворяют в 1 мп дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл свежеприготовленного 100 мМ ИаЛО, перемешивают 20 мин при комнатной температуре, цеализуют ночь при 4 С против 1 мМ буфера а-ацетатного, рН 4,4. Добавляют 20 мкл 200 мМ карбонатного буфера, рН 9, 6,8 мг иммуноглобулинов (растворенных в 1,0 мл 10 мГ 1 карбонатного буфера, рН 9,6) и перемешивают 1 ч при комнатной температуре, Добавляют 0,1 мл свежеприготовленного ИаВН (4 мг/мл воды) и инкубируют 2 ч приа4 С. Добавляют равный объем касьпценного сульфата акчония, центрифугируют, растворяют осадок в воде, диализуют против О, 15 М ИаС 1, добавляют БСА до 2%-ной концентрации, разбавляют в два раза глицерином и хранят при -20 С.1573427 П р и м е р 7. Анализ проводят какв примере б с тем отличием, что натвердой фазе сорбируют антиген теоазо-БСА, а измеряемый объем сывороткисоставляет 10 мкл (разведение 1:0),Л р и м е р 8. Анализ проводят какв примере 7, с тем отличием, что натвердой Фазе был сорбирован коньюгированный антиген тео-азо-ЧСА,Ф о р и у л а и з о б р е т е н и я Составитель А.СкуратТехред М.уоданич Корректор М.Максимишинец Редактор Н,Яцола ф Заказ 1641 Тираж 511 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина,101 П р и м е р 5, Приготовление стандартных растворов теофиллина для построения калибровочных кривых.Точные навески теофиллина раство 5 ряют в воде в концентрации 1 мг/л, затем соответствующие аликвоты этого раствора добавляют к пулу иэ 10 донорСких сывороток так, чтобы получить стандарты, содержащие 1,5, 10,20 и 30 мкг препарата в 1 мл сыворотки,Измерение концентрации теофиллина в сыворотках крови твердофазным иммуноферментным методом.П р и м е р 6. Коньюгированный ан тиген тео-г/а-ЧСА растворяют в 0,05 М Натрийкарбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 1 мкг/мл и сорбируют на полистироловых 96-луноче ных планшетах по 100 мкл/лунку,при 4 С. в течение ночи, затем твердую Фа" зу отмывают 0,057-ным раствором тритона Хтри раза и три раза водой.Аликвоты по 1 мкл иэ сывороток крови больных, получавших теофиллин, или 25 донорских сывороток, содержащих известное количество препарата, разводят до 100 мкл буфером А: 0,0 1 М натрий-фосфатный буфер, содержащий О, 15 МИаС 1, 0,05% твини 0,27. БСА, и сме 30 шивают с 100 мкл 1 я-РО в гом же буфере в концентрации 50 мкг/мл. Смесьтщательно встряхивают и переносят натвердую Фазу с сорбированным антигеном, инкубируют 20 мин, твердую Фазу отмывают и приливают раствор субстрата (4 мкл 303-ной НО и 4 мг ор-.тофенилендиамина на 100 ип 0,1 М нат"рий-цитратного буфера, РН 5,0) детекция при 492 нм, Концентрации теофил- щлина в расчете на разведение аликвотыдо 100 мкл. Иэ полученного значенияпоглощения, равного, например, О,б,можно определить концентрацию теофиллина, вводимого в реакцию с антитела ми, она равна 0,16 мкг/мп, а, соответственно, в исходной пробе 16 мкг/мл,Коэффициент вариабельности метода не превышает 12 ,. Результаты измерения совпадают с данными, полученными методом жидкостной хроматографии высокого давления (коэффициент корреляции 0,98), Таким образом, длительность анализа сокращается на 20 мин по сравнению с известным способом при более высокой чувствительности,Способ определения теофиллина в сыворотке крови, включающий получение антител путем иммунизации животных коньюгированныи антигенои теофиллинбелок, в котором теофиллин присоединен к белку через С 8 положение молекулы, сорбции имиунохимических реа" гентов на твердой Фазе, добавления к иммобилиэованным реагентам полученных антител и исследуемой сыворотки с последующим измерением оптической плотности смеси, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа и его ускорения, для иммунизации используют коньюгат, в котором теофиллин присоединен к белку азо-связью, а в качестве реагентов используют пероксидазу и коньюгат, в котором теофиллин присое" динен к белку пентаиетилендиаминовой связью, причем белок в коньюгате, используемом для сорбции, отличается, по антигенности от белка, используемого для иммунизации.