Способ определения холестерина в биологических тканях

. Люта ( Львовский государственныйинститут 71) Заявнтел едицинскив,.,".:; - :, г,:;: ч) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИН В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ о 0,017, 0,25 1Изобретение относится к биохимии и может быть испс 1 пьзовано в медицине в клинической практике и лабораториях.Известен способ определения холестерина в биологических тканях пу" тем обработки пробы реагентами с последующим измерением светопогло" щения полученной реакционной смеси ЦОднако способ обладает недостат чно высокой чувствительностью.Цель изобретения - повышение чувствительности способа.Поставленная цель достигается тем, что способ определения холе" стерина в биологических тканях осуществляют путем обработки пробы реагентами с последующим измерением светопоглощения полученной реакционной смеси, из пробы экстрагируют липиды, экстракт подвергают исследованию методом инфракрасной спектроскопии в области 950-1200 сми по интенсивности поглощения в области 1065 смопределяют концентрацию холестерина.Способ определения холестеринаосуществляется путем проведениягидролиза эфиров холестерина гидрооксидом калия, экстракцией егоорганическими растворителями,(СС 9,СНСР ), получения сухого экстракта,прессования его в пластинки с бромидом калия и измерении интенсивености поглощения полосы 9 Св области 950-1200 см- . Концентрациюхолестерина рассчитывают по формуле, выведенной на основании статистической обработки калибровочнойкривой методом наименьших квадратовСка: фцудЯгде 0 - оптическая плотность Ф С-О;9 - коэффициенты,полученные в резуль"тате математичес. кой обработки кали"бровочной кривой,(2) 0,81 0,88 0 905 1,17 0,3554 1,44 Для получения калибровочной кривой готовят серию смесей, содержащих точно взвешенное количество холестерина от 0,1 до 1,0 мг в 200 мг КВг. Тщательно размельченной и рав, номерно перемещенной смесью наполняют прессформу, изготовленную известным способом, и прессуют таблетку под вакуумом 0,1-0,2 кПа и давлении 300 кгс/см . Регистрируют ИК-спектр в области 900-1200 см на спектрофотометре 1%-20 при скорости сканирования 64 см/мин,щелевой программе 4. Для полосы0-0 1065 смнаходят значение оптической плотности по методу базовой линии.На табл.1. приведены результаты измерений оптической плотности. Значения оптической плотности т С-О холестерина (табл. КВг) Концентрация, С, мг Оптическаяплотность 0,1308 0,1451 0)1575 0,1684 0,1845 0,2178 0,2255 0,2800 0,2947 0,3373 П р и м е р 1, Количественное определение холестерина в сыворотке крови. В пробирку со шлифом, объемом 25 мл, наливают 10,0 мл спиртовог раствора КОН (24 на 96 СНЕОН) и вводят по каплям 0,5 мл сыворотки24573 4крови. Пробирку закрывают пробкой,хорошо взбалтывают и ставят на водяную баню или в термостат на 1 ч% После проведения гидролиза содержимое пробирки охлаждают и прибавляют 5,0 мл 0014, хорошо взбалтывают.Раствор переносят в делительную1 О воронку, нижний слой, т.е. экстракт001, сливают в сухую пробирку.На аналитических весах точно взвешивают 200,0 мг предварительно растертого спектрально чистого бромида1% калия и помещают в Фарфоровую чашку.Пипеткой отбирают 2,0-3,0 мл(точный объем) зкстракта 000 и выливают на КВг. Растворитель испаряютв сушильном шкафу на протяжение20 10-15 мин при 70-80 С,Полученный сухой остаток хорошорастирают в той же Фарфоровой чашке,полностью переносят в прессформу ипресуют. Получают прозрачную пластинф ку, состоящую из КВг и холестерина.Регистрируют ИК-спектр полученнойпластинки (таблетки) на спектрометре 1 Жв области 950-1200 смприскорости сканирования 64 см/мин,ще 30 левой программе 4, масштабе записи100 см /см, с компенсационной таблеткой состоящей из КВг.Интенсивность измеряемой полосынаходят по методу "базовой" линииу и вычисляют оптическую плотность поформуле где 1 о и 1 - интенсивности погло 4 Фщенного и пропущенногоизлучения,Расчет концентрации холестеринав сыворотке крови с учетом разбавления проводят по Формуле43О+ 0 017 Ч, 1000 259 Ч Чгде Ч 1, Ч 2 - объем 001 ) взятый дляэкстракции (Ч,) и ана 59лизе (Чг)Ч - объем сыворотки крови,3П р и м е р 2. Количественное оп.ределение холестерина в тканях печени, мышцах,фф Для анализа берут 3,00 г печениили другого объекта,(точная навескаиз которых, экстрагируют липиды пометоду Ро 13 с.924573 6Продолжение табл.3 чени, г общий холе стерин холестериндигитонияосажденный 0,3266 , 0,1463 0 3460 0,3130 0,1376 0,1433 0,1506 0,3230 Таблица 4 Взято сыровотки,мл0,1466 0,1416 0,3243 0,3126 3,0 Всю навеску липида растворяют в3,0 мл СНСК , 0,01 мл этого раствораразделяют методом тонкослойной хроматографии (гексан, диэтиловый эфир,уксусная кислота 70 : 30 : 1) . 5Пятна дигитонилсодержащего И общего холестерина вырезают и вымываютиз них холестерин 3,0 мл СНС 1На аналитических весах точновзвешивают 200,0 мг предварительно 10растертого спектрально чистого бромида калия и помещают в фарфоровую чашку.Полученный раствор холестерина(3,0 мл) выливают на бромид калия.Растворитель испаряют в сушильномшкафу на протяжение 10-15 мин при70-8 ООС.Полученный сухой остаток хорошо растирают в той же фарфоровой чашке,полностью переносят в пресс-форму и прессуют. вПолученную прозрачную пластинку, состоящую из КВг и холестерина,анализируют, как описано в примере 1,Расчет концентрации холестеринапроводят по формуле (1).В табл. 2-4 представлены результаты количественного определенияхолестерина в крови, тканях, сыворотке крови соответственно,Таблица 2 ЗоРезультаты количественного определения холестерина в кровиТаблица 3Результаты количественногоопределения холестеринав тканях (ИК-спектроскопия) общий холе- холестерин стерин дигитония осажденныйе вв Найдено холестеринаВзято пе- мг/г печени Результаты количественного определения холестерина в сыворотке крови (фотокалоримет-рия) Предлагаемый способ (по сравнению с клиническими методами анализа) дает возможность с большей точностью определить холестерин в биологических объектах,Применение кристаллических образцов (аластинка КВг) создает удобство в работе и повышает чувствительность метода,.что позволяет использовать для анализа меньшее количество биоматериала. формула изобретения Способ определения холестерина в биологических тканях путем обработки пробы реагентами с последующим измерением светопоглощения полученной реакционной смеси, о т л и 7 924573 8ч а ю щ и й с я тем, что, с целью поглощения в области 1065 см:опреповышения чувствительности способа, деляют концентрацию холестерина. из пробы экстрагируют липиды, экст- Источники информации, ракт подвергают исследованию методом принятые во внимание при экспертизе инфракрасной спектроскопии в облас-1. Патент США 11. 3884638,ти 950-1200 сми по интенсивности кл. 6 О 1 Х 33/16, 1975.Составитель С. Малютина.Редактор С. Юско Техред Т.Маточка Корректор М. ПожоЗаказ 2806/60 Тираж 883 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная,4