Способ диагностики диффузного гломерулонефрита

) Авторыизобретеии В.А. Кулганов и В.Л. Заявител СОБ ДИАГНОСТИКИ ДИФФУЗНОГ ГЛОИЕРУЛОНЕФРИТА и- при способ диагностики диферулонефрита путем опреворотке крови пациента ческих Фракций Фосфатиосфатидилхолина, фосфамина, фосфатидной кислония содержания в них сфора с последующим сраволичества в каждой фракй полученной из сыворотчеловека 111вестный способ не обесобходимой точности диагузного гломерулонефрита. ретения - повышение точИзобретен цине, а имен агностики сг гломерулонеф пиелонефрите Известен фузного глом деления в сы хроматографи дилсерина, фтидилэтанола ты, определе липидного фо нением его к ции с таково ки здорового Однако из печивает не ностики дифф Цель изоб ности способ Поставлен тем, что при диагностикие относится к медио к нефрологии дляицерофосфолипидемийите и хроническом ая цель достигаетсяосуществлении способаиффузного гломерулоне 2рита путем определейия в сыворотке крови пациента хроматографических фракций Фосфатидилсерина, фосфатидилхолина, Фосфатидилэтаноламина,фосфатидной кислоты, определения содержания в них липидного Фосфора с последующим сравнением его количества в каждой Фракции с таковой, полученной из сыворотки здорового человека, дополнительно выделяют фракцию сфингомиелина и определяют в ней содержание липидного фосфора.Способ осуществляют следующим образом.К сыворотке крови 1,0 мл добавляют 10,0 мл смеси хлороформ-метанола объемная пропорция 2:1), Содержание пробирок перемешивают и выдерживают на водяной бане 30- 40 мин при 40-45 С. Этим достигают выделение липидов из липопротеиновых комплексов и осаждение денатурированного белка. Содержание пробирок фильтруют через складчатый92457 3фильтр в дрозофильные стаканчики. Для удаления из экстракта водорастворимого фосфора на Фильтрат наслаивают 15-20 объемов дистиллированной воды. Ее добавляют до верха стаканчика и ставят в сосуд также с дистиллированной водой на ночь. На следующий день верхнюю водную Фазу осторожно удаляют с помощью водоструйного насоса, а к нижней (хлороформен ной фазе, содержащей липиды) добавляют по каплям метанол (1-2 мл) до полного растворения тонкого пограничного слоя-пленки. Затем производят выпаривание в термостате при 50- 15 55 С. После выпаривания липиды растворяют,в 0,5 мл смеси хлороформ-метанола 12:1) и наносят шприцем на пластинки с тонким слоем силикагеля (марки КСК), который предвари- щ тельно измельчают на шаровой мельнице, отмучивают и отмывают от примесей железа. Используют частицы размером 200 меш.,Размер пластинок 13 х 18 см. Силикагель тщательно пере мешивают с водой и полученную однородную массу наносят на пластинку, находящуюся на столике со строго горизонтальной поверхностью. Непосредственно перед нанесением ли- Зр пидов пластинки с силикагелем активируют в термостате при 110 ОС в течение 50 мин. Перед нанесением вещества пластинку с адсорбентом выдерживают в камере для насыщения силикагеля аммиаком до тех пор, пока Фронт растворителя не достигнет верх-. него края пластинки. Липиды наносят полоской шириной 15-20 мм на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки. Разгонку производят в камере с системой растворителей хлороформ-метанолИ %1 з 60: 35: 5) в течение 35-50 мин. При этом хлороформ и метанол после соответствующей обработки хлороформ после высушивания над СаС 1 и метиловый спирт после абсолютирования) перегоняют. Хроматографирова гь повторно в одной и той же порции растворителей не рекомендуется. Растворитель заливают в камеры за 1 ч до погружения в них пластинок, Для лучшего насыщения стенки камеры с внутренней стороны до дна покрывают фильтровальной бумагой. Оптимальная температуо ра для разделения фосфолипидов 22 С Пои более низких температурах растворитель проходит через пластинку очень медленно, при более высоких получается нечеткое деление, После разделения хроматограмму вынимают из камеры и сушат в термостате при 50 С а течение 30-40 мин. Для проявления Фосфолипидов используют пары йода. Йод окрашивает липиды, имеющие ненасыщенные связи, в темно- коричневый цвет. Насыщенные липиды слабо окрашиваются парами йода. Окрашенные пятна обводят препаровальной иглой. Для идентификации Фосфолипидов используют характерные цветные реакции и изменение величин ВГ - отношение расстояния от старта до середины идентифицируемого пятна к расстояние от старта до фронта. В качестве специфических проявителей применяют раствор нингидрина, аммиачный раствор азотнокислого серебра, реактив Драгендорфа и родамин 6 У. Применение цветных реакций и величины М позволяют идентиФицировать 5 Фракций: фосфатидилсерин, сфингомиелин, фосфатидилхолин, Фосфатидилэтаноламин, Фосфатидную кислоту. Перед определением Фосфолипидов строят калибровочную кривую по стандартному раствору КН 2 РО,1. Далее каждую фракцию переносят в пробирки для сжигания, куда добавляют по 1 мл 724-ной НС 1 О, Сжигание длится 34-45 мин. После этого добавляют в пробирки по 1 мл воды и переносят в центриФужные пробирки. Время центрифугирования 10 мин при 3000 05 мин.Процедуру повторяют дважды, М центриФугату добавляют по 0,2 мл 54-ого молибдата аммония и 0,2 мл эйконогена, Содержание пробирок перемешивают и доводят водой до 5 мл. В качестве контроля берут силикагель из тех зон .хроматограмм, где не обнаружено наличие Фосфолипидов, и проводят все операции, как и для проб. Фотометрию осуществляют на Сфпри длине волны 830 нм. Расхождение в определении глицерофосфолипидов в параллельных пробах не превышает в среднем 54, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости, метода, Результаты выражают в микрограммах липидного фосфора, а окончательно в процентах.П р и м е р 1, Больная Р-ва Е,Г 41 год, диагноз: острый диф9245 20 5фузный гломерулонефрит с изолированным мочевым синдромом; Хроматограмма фосфолипидов; фосфатидилсерин (ФС) 12,64, сфингомиелин (Сф)16,7, фосфатидилхолин (ФХ) 56,74, зфосфатидилэтаноламин (ФЭА) 10;8 Ж,фосфатидная кислота (ФК) 3,2/.П р и м е р 2. Больной О-н Н.В.,37 лет, диагноз: острый диффузныйгломерулонефрит с нефротическим осиндромом. Нефрогенный отек легких.Остаточные явления рожистого воспаления в области голеней, Хроматограмма фосфолипидов: ФС 8,84,Сф 13 ф 5 фф ФХ 56 ф 34 у ФЭА 17,5/офФК 3,53.П р и м е р 3. Больной П-в В.ф.,48 лет, диагноз: хронический диффузный гломерулонефрит с изолированныммочевым синдромом. Сопутствующиезаболевания: хронический бронхит.Эмфизема легких, дыхательная недостаточность. Хроматограима Фосфолипидов: ФС 11,34, Сф 22,7,ФХ 50,74,ФЭА 4,5/ иП р и м е р 4. Больной П-нь В.ф.,49 лет, диагноз: хронический диффузный гломерулонефрит с гипертензивным синдромом. Сопутствующие заболевания: пневмофиброэ. Хроматограмма ЗоФосфолипидов: ФС 14,й, Сф 19,9,ФХ 49,14, ФЭА 13,2 ооо, ФК 3,4.П р и м е р 5. Больной Б-в. Ю.П.34 лет, диагноз: хронический диффузный гломерулонефрит смешанноготипа, фосфолипидограмма: ФС 12,74,Сф 12,4 оо, ФХ 45,34, ФЭА 19 9 оо,ФК 9,7/о.П р и м е р 6. Больной П-в Б;А.,43 лет, диагноз: хронический диф Офуэный гломерулонефрит в терминальной стадии. Фосфолипидограмма:ФС 10,74, Сф 28,2/о, ФХ 45,94,ФЭА 11,6/, ФК 3,64.П р и м е р 7. Больная В-ваИ.П., 47 лет, диагноз: хроническийпиелонефрит беэ нарушения аэотовыделительной функции почек преимущественно с поражением одной почки.Сопутствующие заболевания: гипертони- вческая болезнь 11 ст., церебро-кардиальный вариант. Диффузный эутиреоидный зоб, Фосфолипидограмма:ФС 15,6/, Сф 17,3/, ФХ 30,1 Ж, ФЭА23,7.// ФК 13,3/о . И П р и м е р 8, Больная 3-ва О.А., 54 лет, диагноз: хронический пиелонефрит без нарушения азотовыделитель 72 6ной функции почек с преимущественным поражением обеих почек. Фосфолипидограмма: ФС 14,74, Сф 19,2,ФХ 31,4/о, ФЭА 22,14, ФК 12,64.Предлагаемый способ был примененпри обследовании 123 больных в возрасте от 11 до 73 лет. Наблюдениемустановлено, что повышение однойфракции ФХ от 44,0 до 61,0 Ж и уменьшение трех фракций: ФС от 17,1 до6,3/, ФЭА от 22,0 до 4,й, ФК от10,8 до 0,6/о свидетельствует обостром диффузном гломерулонефрите;отличие от нормы пяти фракций " повышение двух фракций: Сф от 14,7 до23,9/о, ФХ от 33,6 до 63,73 при понижении трех фракций: ФС от 155до 8,3/, ФЭА от 25,7 до 4,03, ФК от 8,3 до 1,8 О/ - подтверждает диагноз хронического диффузного гломеру лонефрита с изолированным мочевыми нефротическим синдромом; отличиеот нормы трех фракций - повышениеодной фракции ФХ от 31,8 до 59,8 Фи понижение двух фракций: ФЭА от22,8 до 8,4, ФК от 11,1 до2,1/ - свидетельствует о хроническом диффузном гломерулонефрите сгипертензивным синдромом;отличие двух фракций от нормы - повышение одной Фракции ФХ от 25,9 до 61,9и понижение одной фракции ФС от 17,14 до 7,1/о - говорит о наличии хронического диффузного гломерулонефрита смешанного типа; отличие от нормы одной Фракции - понижение ФС от 13,8 до 5,4 - подтверждает диагноз хронического диффузного гломерулонефрита в терминальной стадии,Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить пять фракций и выгодно отличается от известного способа, тем, что Фрак ции сфингомиелина и Фосфатидилсерина совершенно четко делятся и, таким образом, исключаются погрешности при определении липидного фосфора в них, что увеличивает воэможность более точной диагностики диффузного гломерулонефрита. формула изобретения Способ диагностики диффузного гломерулонефрита путем определения в сыворотке крови пациента хроматографических фракций фосфатидилсери924572 8 ределяют в ней содержание липидного фосфора составитель 6, АлмазовТехред Т.Маточка Корректор В. Синицкая Редактор С, Юско Тираж 883 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, И, Раушская наб., д,4/5, Заказ 2806/60 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород,ул, Проектная,4 на, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидной кислоты,определения содержания в них липидного фосфора с последующим сравнением его количества в каждой Фракции с таковой, полученной из сыворотки здорового человека, о т л и ч а ющ и й. с я тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительновыделяют фракцию сфингомиелина и оп О Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Смирнова Н.Н. Изменения содержания глицерофосфолипидов при диффузном гломерулонефрите у детей,Автореф. дис, на соиск. учен, степени канд. мед. наук. Л., 1974,