Способ определения активности глюкоамилазы

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 920069/3 Гооудорстееииык комитет СССР по делам иаобретеиий(088. 8) вано 15 0 бликовани открыт ния 15. О. 8 ата о пи Нлопак, А.П,Рухлядева, ворцова, В.Л.Яровенко А,Н,Пономарев оры обретен(71) Заявител И ГЛЮКОАИИЛАЗЫ 5") СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИ кже труднодоступ высокая стоимост нения анализа,ност ь, слонностреактивов,олити цес бъекте в приводит к у Рзультатов,Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности является способ определения активности амилолитицеских Ферментов, в том числе глюкоамилазы путем ферментативного гидролиза субстрата, инактивирования ферментов соляной кислотой, осветлениярастворов Фильтрацией, поляриметрикого определения углеводов в двестадии соответственно до и после ферментативного гидролиэа и расчета величины активности ферментов по специально разработанным Формулам 2,Однако данный способ неспецифичени предназначен для определения общегосуммарнбго действия всех амилолити 15 цеслия Изобретение относится к спиртовойи микробиологической промышленности,а именно к способам определения активности Фермента глюкоамилаэы.Известны глюкозооксидазные способы5определения. активности глюкоамилазы,согласно которым 0,674-ный растворкрахмала подвергают ферментативномугидролизу глюкоамилазой при 30 оС втечение 10 мин, ферментативную реакцию останавливают кипячением, а глюкозу, образовавшуюся в резул ьт ат еФерментативного гидролиза крахмала,определяют при помощи реактивов глюкозооксилаэы и пероксилаэы, являющихся ферментами, а также хромогенноговещества, например, ферроцианида ка"Возникающая окраска отракаетколицество глюкозы, образовавшейся приФдействии глюкоамилазы на крахмал, Интенсивность окраски определяют колориметрицески 11,Недостатками этих способов являются трудоемкость и длительность выполго, присутствие других ам х Ферментов в исследуемом начительных количествах пол чению завышенных ед РдПи 1 где и - количество Фермента, взятоена Ферментативной гидролиэ(мп или г);время ферментативного гидрллиэа (мин); 3 92006ческих Ферментов, имеющихся в исследуемом объекте.Недостатком способа является такженеоднозначность полуцаемых результатов иэ-за различий в величине удельного вращения углеводов, получаемыхпри ферментативном гидролизе, а такженеобходимость осветления и фильтрования растворов перед поляриметрией.Цель изобретения - специфическое 10определение активности глюкоамилазыв присутствии амилолитических ферментов, а также ускорение и упрощениеспособа,Цель достигается тем, что согласно способу определения активностиамилолитических Ферментов путем ферментативного гидролиза субстрата,инактивирования Фермента соляной кислотой, поляриметрического определе 20ния углеводов в две стадии, соответственно до и после Ферментативногогидролиза и расчета величины активности ферментов, в качестве субстратадпя Ферментативного гидролиза используют мальтозу, поляриметрирование ведут при 3, = 587-589 нм, а расчетведут по изменению угла поворота плоскости поляризации на первой и второйстадиях, соответствующему количеству30образовавшейся глюкозы или количеству единиц глюкоамилазной активности,определяемой стандартным глюкозооксидазным методом.Способ осуществляют следующим образом,Проводят первую стадию анализа(контроль). В пробирку вносят 25 млнагретого до 50 С 23-ного растворамальтоэы в 0,1 М ацетатно-натриевомбуфере с рН 1,7 (раствор мал ьтозы40должен быть приготовлен не менее,чем за сутки до анализа для установления в нем постоянной величины углаповорота плоскости поляризации), Затем в пробирку вносят 1 мл 5 н соля 45еной кислоты и 5 мл испытуемого раствора глюкоамилаэы, нагретого до 50 С,После ферментативного гидролизаосуществляют 2-ю стадию. В другуюпробирку вносят 25 мл раствора мальто эы, приготовленной таким же образоми нагретого до 50 С, а затем 5 млиспытуемого раствора глюкоамилазы,нагретого до 50 С, и проводят ферментативный гидролиз мальтоэы глюкоамилазой в течение 10-0 мин (преимущественно 15 мин) в ультратермостаг 0+О 2 Затем Ферментативную реакцию останавливают добавпением 1 мл 5 н 11 С 1.После охлаждения растворов до комнатной температуры определяют величину угла поворота плоскости поляризации на поляриметре СУили на автоматическом поляриметДе Е-ПЛ или СЛ,имеющих нормальную сахарную шкалу,Определение проводят при длине волныА "- 587-589 нм, пользуясь трубкойдлиной 2 дм,Изменение величины угла поворотаплоскости поляризации до и после Ферментативного гидролиза соответствуетобразованию из мальтозы глюкозы в качестве единственного продукта действия глюкоамилазы на мальтоэу, чтопозволяет получить совершенно однозначные результаты при определенииглюкоамилаэы независимо от присутствия других амилолитических Ферментов.Изменение величины угла поворотаплоскости поляризации до и послеФерментативного гидролиза пропорционально количество глюкоамилаэы и времени ее действия на мальтоэу.Поэтому расчет активности глюкоамилазы не требует создания специальных Формул, а производится по пропорции между количеством фермента,взятого на анализ, временем его действия и величиной изменения угла поворота плоскости поляризации до и после Ферментативного гидролиэа,Расчет производят следующим образом: где Р - величина угла поворота плоскости поляризации на 1-йстадии (градусы нормальнойсахарной шкалы);Р - величина угла поворота плосокости поляризации на 2-йстадии (градусы нормальнойсахарной шкалы);дР - изменение величины угла поворота плоскости поляризации на 1-й и 2-й стадиях920069 8 литической активности. И 1975, с.45. Составитель Е. ВоробьеваРедактор Н.Киштулинец Техред А, Ач Корректор Л. Бокшан Заказ 2267/23 Тираж 505 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Иосква, Ж, Раущская наб д, 4/5 Филиал ППП "Патент", г,. Ужгород ул. Проектная, 4 определяемой стандартным глюкозооксидазным методом.,Источники инФормации,принятые во внимание при экспертизе1, ГОСТ 20264-4-74. ПрепаратыФерментные. Иетоды определения эмило 2, Авторское свидетельство СССР М 619856, кл. С 01 Ы 33/14, опублик, 1977,