Способ получения l-треонина

(19) (И) 3/08 ц)5 С ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК АВТОРСКОМУ С 8 ИДЕТЕЛЬСТВУ г юл, У 31аучно-исследоват етики и селекции иц, А.К.Соколов,Н.И.Жданова, Ю.И.Козлов(4) (57 предусм пригото тем выр бактери-ТРЕОНИНА, е операций ериала пу- треонина- посевной СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ тривающий проведен ления посевного ма щивания процуденто ЕвсЬегсЬда со 1 д вкробио частно Изобретение относится к гической промышленности,чення аминокислоты ти к спос н олжишая кже треонина тельностБлижа техничес эффекту ферментации.шим техническиой сущности ивляется способ м поому реш сти лу ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ П(НТ СССР(71) Всесоюзный нский институт генмикроорганизмов(53) 668.392 (088,8) 1. реонина.Известен способ получения 1 -треоина, предусматривающий культивирование его продуцентов бактерий ЕвсЬегсЬа со 11 на питательной среде, садер жащей источники углерода, азота, минеральные соли и антибиотик, с последующим выделением целевого продукта.Недостатком известного способа является невысокий уровень накопления питательной среде, введения посевногоматериала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода, азота и минеральные соли, добавления гидролизата белоксодержащегосубстрата и последующую ферментациюв глубинных условиях, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью расширения сырьевой базы, а также удешевлефния способа, в качестве продуцентовтреонина используют штамм ЕвсЬегсЬасо 1 д (ВНИИгенетика - 472 Т), при этомвыращивание продуцентов ведут в жидкой посевной среде, а добавление гидролизата белоксодержащего субстратаосуществляют непосредственно в посевную питательную среду. 1,-треонина, предусматривающий приготовление посевного материала путем выращивания продуцентов треонина - бактерий ЕвсЬегсЬа со 1 д в посевной питательной среде, введение посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода, азота и минеральные соли, добавление гидролизата белоксодержащего субстрата с последующей ферментацией в глубинных условиях.Сущность способа заключается в том, том, что в качестве продуцента 1. - треонина используют штамм микроорганизмов ЕвсЬегсМа со 1 ВНИИ генетики М, содержащий амппифицированную гибридную плазмиду, а в ферментационную,среду вводят питательную добавкув виде гидролизатов белоксодержащихсубстратов и процесс ферментации ведут в присутствии пенициллина. Посевной материал выращивают в присутствиипенициллина и в виде клеточной суспензии вводят непосредственно в ферментационную среду.Недостатком этого способа являетсясравнительно высокий расход таких фкомпонентов ферментационной среды,как глюкоза, пенициллин и гидролизатбелоксодержащих субстратов.Целью предлагаемого изобретенияявляется расширение сырьевой базы,а также удешевление способа,Поставленная цель достигается тем,что в способе получения 1,-трйонина,предусматривающем проведение операцииприготовления посевного материала путем выращивания продуцентов треонина -бактерий ЕзсЬегсМа со 1 х в посевнойпитательной среде, введения посевногоматериала в ферментационную питательную сРеду, содержащую источники углерода, азота .и минеральные соли, добавления гидролизата белоксодержащегосубстрата и последующую ферментациюв глубинных условиях, в качестве продуцента треонина используют штаммЕзсЬегсйха со 1 ВНИИгенетика 472 Т,при этом выращивание продуцентов осуществляют в жидкой посевной среде,а добавление гидролизата белоксодержащего субстрата осуществляют непо-средственно в посевную питательнуюсреду.Сущность предлагаемого способазаключается в следующем.Штамм Е.со 1 ВНИИ генетика 472 Тполучен на основе штамма Е.со 1 ВНИИгенетика Мпутем введения в клеткиэтого штамма генетических детерминантов усвоения сахарозы с последующейселекцией на устойчивость к треонину 45и гомосерину, В качестве донорногоштамма, имеющего детерминанты усвоения сахарозы, испольэовали соответствующий штамм Е,со 1 д; в частности,штамм Н.50Указанные детерминанты методомконъюгации были введены в штаммЕ.со 1 458 требующий для роста треонин, метионин и устойчивый к стрептомицину, а затем из штамма 458 такимже методом - в штамм ВНИИгенетика М 1,продуцирующий треонин. Отбор рекомбинантов вели на минимальной среде,содержащей сахарозу в качестве единственного источника углерода. В результате был отобран штамм ВНИИгенетика 472, который сохранил способность продуцировать треонин на средес глюкозой и приобрел способностьк накоплению этой аминокислоты на среде с сахарозой или мелассой, В связис тем, что рост этого штамма подавлялся в присутствии высоких концентраций треонина и гомосерина в среде,были получены спонтанные мутанты, устойчивые к этим аминокислотам присодержании их в среде в количествеболее 0,5 г/л. Среди указанных мутантов был отобран штамм ВНИИгенетика472 Т.Характеристика штамма ЕзсЬегспдасо 1 д ВНИИгенетика 472 Т,Штамм Е.со 1 ВНИИгенетика 472 Т,продуцирующий Т-треонин, хранится вЦентральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика"и имеет регистрационный номер ЦМПМВ.Морфология, Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами, размером 1,5-2 ммв длину.Культурально-физиологические признаки.Мясо-пептонный агар. Через 24 чроста при 37 С образует круглые беловатые, полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колониигладкая, слегка блестящая, края ровные или немного волнистые, центр колонии приподнят, структура однородная,консистенция пастообразная, легкоэмульгируется.Агаризованная минимальная средаАдамса с глюкозой, Через 40-48 ч росота при 37 С образует колонии диаметром 0,5-1,5 мм, серовато-белые, слегка выпуклые, с блестящей поверхностью,через 4-5 суток колонии приобретаютслизистую консистенцию,Рост в мясо-пептонном бульоне. После 24 ч роста при 37 С сильное равномерное помутнение, небольшой осадок,езапах характерный,Рост в жидкой минимальной средеАдамса. Через двое суток роста в условиях аэрирования при 37 С. сильноеравномерное помутнение, запах характерный.Рост по уколу в мясо-пептонномагаре хороший по всему уколу.Желатину не разжижает,4325 410,2 210,2 П р и м е р 2. Продуцент Ь-треонина и условия выращивания посевногоматериала те же, что и в примере 1,за исключением содержания гидролизатабелоксодержащего субстрата, который 50 был использован в количестве 0,2 Х.Через 28 ч выращивания посевной мате-.риал (в количестве 103 от объема среды) ввели в ферментационную питатель"ную среду, имеющую состав, Х;55 Сахароза8Сульфат аммония . 1Калий фосфорнокислый 0,2Двуэамещенный магнийсернокислый 0,04 5 90На молоке - хороший рост с коагуляцией молока.Индол - образует.Рост на углеводах: хорошо растет на глюкозе, сахарозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе, глицерине, манните.Устойчивость к антибиотикам - устойчив к пенициллину.Штамм не патогенен.Содержание плазмиды. В экспоненциальной стадии роста культуры клетки содержат многокопийную плазмиду (молекулярный вес 5,8 мегадальтон),обеспечивающую устойчивость штамма к пенициллину и несущую гены треонинового оперона.Клетки продуцента ВНИИ-генетика 472 Т выращивают на агаризованной минимальной среде в присутствии пенициллина, а затем суспензией клеток, смытых со скошенного агара, засевают жидкую питательную посевную среду, содержащую источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, мел, пенициллин и питательную добавку в виде гидролизатов белок-содержащих субстратов. Посевнойматериал выращивают в колбах на качалке или в ферментерах при непрерывном аэрировании и перемешивании при температуре 35- 37 оС в течение 20-30 ч.Выращенный посевной материал вносят в ферментационную среду, содержащую источники углерода, азота и необходимые минеральные соли. В качестве источников углерода применяютсахарозу; глюкозу технический сахар, мелассу. Ферментацию продуцента треонина осуществляют на ферментерах, оснащенных системой РН-статирования, при непрерывном аэрировании и перемешивании при температуре 36 С.оВ качестве титрующего агента при-. меняют аммиачную воду, либо сбалансированную (по углероду и азоту) подпитку. Продолжительность культивирования 30-55 ч. К концу ферментации в культуральной жидкости накапливается до 32 г/л 1-треонина. Выделение Ь-треонина осуществляют одним из известных способов.П р и м е р 1, Культуру продуцента Е.со 1 д ВНИИгенетика 472 Т, выращенную на агаризованной минимальной среде с глюкозой в присутствии пенициллина, пересевали на жидкую посевную питательную среду следующего состава, Х: СахарозаСульфат аммонияКалий фосфорнокислый5Двузамещенный магнийсернокислый 0,04Гидролизат белоксодержащего субстрата 0,5Пенициллин 0,5 г/л 10 Мел 1Выращивание посевного материалапроводили в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл (объем среды - 100 мл)на качалке (240 об/мин) при температуре 35-37 С, Продолжительность выращивания посевного материала 20 ч.Полученным посевным материалом засевали ферментационную среду (в количестве 5 Х от объема среды) следующего 29 состава, Х;ГлюкозаСульфат аммонияКалий фосфорнокислыйДвузамещенный магний25 сернокислый 0,04ферментацию проводили в ферментерес рабочим объемом 0,5 л, оборудованном системой РН-статирования. Режимферментации: расход воздуха 0,5 л/мин,перемешивание 900 об/мин РН-(татирование на уровне 7,0-7,2 за счет подачищелочного титрующего агента, подпитки,.имеющей состав:Аммиачная вода25 Х-ная, мл 25 35Глюкоза, г 60Вода водопроводная, мп 150Ферментацию вели при температуре37 С. Через 36 ч культивирования наокопление 1.-треонина в культуральнойжидкости составило 20 г/л; расходглюкозы на 1 г треонина 4,5 г.904325 Корректор С.Черни Редактор Е.Иесропова Техред И.Дидык Заказ 3086 Тираж 482 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 ферментацию проводили в ферментере с рабочим обьемом 0,5 л, оборудованном системой РН-статирования. Условия культивирования продуцента треонина те же, что и в примере 1. Для поддер-. жания РН на уровне 7,0-7,2 использовали водный раствор аммиака с концентрацией 33. В ходе ферментации по мере снижения концентрации сахарозы в культуральной среде в ферментер дробно вводили 403-ный раствор сахарозы.Через 54 ч культивирования в культуральной жидкости накопилось 32 г/л Ь-треонина, расход сахарозы составил 15 4 г на 1 г треонина.П р и м е р 3. Продуцент Ь-треонина и условия выращивания посевного материала те же, что и в примере 1. Выращенный посевной материал вводили в ферментационную питательную среду, имеющую тот же состав, что и в примере 2. Отличие от примера 2 состояло в использовании мелассы в количестве 163 (по техническому весу), вме вместо сахарозы. Условия культивирования продуцента Ь-треонина и методика РН-статирования те же, что и в примере 2. Через 29 ч ферментации в культу ; ральной среде накопилось 16 г/л Ь- треонина, расход сахара на 1 г трео" нина составил 4,8 г. Как видно из примеров, предлагаемый способ получения Ь-треонина позволяет использовать в качестве источника углерода доступные технические источники углеводов, при одновременном снижении расхода углеводов в .1,2-1,5 раза по сравнению с известным способом. Кроме того, расход гидролизата белоксодержащих субстратов и пенициллина снижается в 10 раз, При этом, благодаря снижению содержания посторонних примесей облегчается процесс выделения Ь-треонина из культуральной жидкости,