Способ получения препарата на основе белковой сыворотки

Союз Советскик Социалистически Республик(23) Приоритет Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Иностранец Маркус Радовитц(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БЕЛКОВОЙ СЫВОРОТКИ Изобретение относится к химико- фармацевтической промышленности и касается получения препарата на основе белковой сыворотки.Известен способ получения пре парата на основе белковой сыворотки путем фракционирования плазмы с последующей адсорбцией, очисткой и сте,. рилизацией 11.Однако известный способ не позво О ляет получить препарат с высоким содержанием иммуноглобулина. Целью изобретения является повышение содержания иммуноглобулина.Эта цель достигается тем, что плазму освобождают от продуктов коагуляции, фракционируют по способу Кона, из полученной после фракционирования фракции 111 выделяют фракции 2 О 111-1 и 111-11, последние смешивают с фракцией 1 Ч и суспендируют смесь в физиологическом растворе.Способ осуществляют следующим образом. 25Из плазмы удаляют сырой фибриноген, 53,3-ный холодный этанол доводят до 8-ной концентрации. При этм температуру поддерживают - 2,5-3,0 С. Осадок Рт -фибриноген удаляют цени- , 3 О 2трифугированием. Супернатант 51 обрабатывают дальше.Затем к выдержанному супернатанту 5 опять добавляют 53,3-ный этанол, концентрацию которого в жидкости устанавливают равной 18-25. Температуру при этом подцерживают - 5 ОС, рН 5,8. Выделяется преципитат Р, который обозначают фракцией - -глобулина. Этот преципитат содержит иммунный глобуин и другие физиологически важные протеины, При температуре - 5 вС преципитат удаляют путем центрифугирования. Супернатант 5 подвергают дальнейшей обработке. Концентрацию этанола устанавливают 40. Температуру на этой ступени поддерживают равной - 7 С, а рН 5,8. Осадок также центрифугируют (Рз) и его обозначают Фракцией 1. Он содержит -Аи 1 Ь-глобулин.Оставшуюся жидкость, супернатант 5 о затем обрабатывают далее.На этой ступени поддерживают температуру - 7 ОС, рН 4,8. Концентрация этанола 40. При этом выделяется преципитат Р 4, так называемый сырой альбумин, который очищают и стерилизуют. Оставшуюся жидкость, супернатант 5 л, выбрасывают.-глобулиновую фракцию 11- обрабатывают далее следующим образом.Осадок Р погружают в цитрат-фосфатный буфер с рН от 7,0 до 7,4, притемпературе 15 С. Добавляют 3 полиэтияенгликоль 4000 (РЕ У ) или 2,5РЕ6000, 3После реакции, продолжающейся от30 мин до 4 час, смесь подают нацентрифугу. Получают супернатант 5 и Фракцию 111-1 (осадок Ру).ФЬСупернатантеще раз обрабатывают и Фракционируют при рН 4,6, количество РЕ 94000 - около 5 при температуре -15 С), Получают Фракцию111 (осадок Р ), а также супернатант56, который, главным образом, содер"жйт.иммунный глобулин, Глобулин фракции 111- и 111 значительно обогащениммунными глобулинами 96, 9 А 9 Н.Кроме того, он содержит -антитрипсин, А-хаптоглобнн, церулоплазмин,траноферрин и хаемопексин.Фракции 111 в и 1 далее не обрабатывают.В качестве исходного продуктаприменяют как фракцию 1 Ч, так и фракции 111-1 и 111.Их смешивают в установленных соотношениях, причем в общих протеинахсодержится от 50 до 70 альбулина илиот 50 до 30 глобулина. 36Также возможно путем соответствующего повышения добавки части глобулина или Фракций 111-1 и 111 повысить долю глобулина. 1 дй и, 9 А,Фракции 1 Ч, 111-1 и 111 суспензиру-Зют в растворе поваренной соли или вдругом пригодном буферном. растворе,вес.:Фракция 1 Ч 30-80ФРакЦия 111-1 0-70Фракция 111 0-70,40причем общее количество протеинов100.Препарат на основе белковой сыворотки можно получать только из какой-либо одной из фракций 111-1; 111 Цили 1 Ч и получить специфичные плаз,мопротеины из отдельных Фракций вустойчивой, растворенной форме в качестве препарата. Препарат можно получить из смеси полученных конечных рпродуктов фракций 11-1, 1. и 1 Ч,Вещества, смешанные в определенных соотношениях и суспензированные.в пригодном буферном раствореили в растворе поваренной соли, подвергают предварительной очистке. Припредварительной очистке путем адсорбции на пригодных адсорбентах (аэрозил,бентонит или другие кремнийсодержащиекомплексные соединения) удаляют липидные факторы- и-глобулинов. После 40этогб продукт фильтруют, диализируюти устанавливают нужную концентрациюраствора.Для устранения вирусов производятпастеризацию путем нагрева до 60 С 65б в течение 10 часов. Однако прн этихусловиях возможна денатурация протеинов сыворотки или же обрабатывают-пропиолактоном и ультрафиолетовымилучами,Способ поясняется следующими примерами.П р и м е р 1. К 300 л раствора .поваренной соли (дистиллированная вода с 1,7 по весу МаС 1, который получают в помощью 6,2 н. НС с рН 4,6)добаВляют 10 Ер СОНМ фракции 1 Ч соследующим анализом белка и суспендируют, :Альбумина 55,Д-Глобулина 10А -Глобулина 8-Глобулина 15Я Глобулина .12Фракция 1 Ч содержит около 50 твердых веществ (белок, соль) и 50 влажного остатка (НО, остаточный этанол),Далее добавляют 5 1 р СОНМ фракции11-1 (субфракция) со следующим анализом твердых составляющих, вес.:Альбумина 15А. -Глобулина 2А-Глобулина 13( - Глоб ули на 17-Глобулина, 53и 5 Мр СОНМ субфракции 11-2 со следующим анализом суспензируется, вес.:Альбумина 8о(,1-Глобулина 3А-Глобулина 9-Глобулина 55Соотношение твердого вещества и влажного остатка во всех Фракциях практически одинаковое,20 1 р флажной фракции суспензируют в растворе и перемешивают. Приэтом значение рН поддерживают постоянным и равным 4, б. Растворимая субстанция, имеющаяся в растворе, растворяется. Имеющаяся нерастворимаясубстанция дает помутнение раствораи составляет около 12 по отношениюк всему количеству твердых составляющих. Среди нерастворимых веществ имеются, в частности, денатурированныеглобулины, включая липопротеиды, которые на дальнейших ступенях способане нужны. Последние удаляют путемцентрифугирования.Оставшаяся жидкость имеет слабуюмутность и желтоватый цвет.Добавляют 0,2 МаОН, .устанавливают значение рН на 7,4. В раствор до- бавляют чистую колоидную кремниевую соль до достижения концентрации 5 вес. и все перемешивают. Жидкость подогревают до 45 С (около 1 в минуту) и значение рН поддерживают постоянным. После достижения температуры 45 С жидкость перемешивают в течение 4 часов. Во время процесса длительноустойчивые протеинысоединяются с кремниевой кислотой и образуют осадок, который удаляют центрифугированием.Жидкость, оставшуюся после центрифугирования, осветляют при пропускании ее через фильтр с активированным углем. После этого фильтрат становится прозрачным янтарного цвета. Далее жидкость концентрируют до 25 по отношению к исходному объему с по мощью способа диаконцентрации (миллипоры - кассетная система, мембра на - величина пор 10.000 дальтон). После этого концентрация белка в растворе составляет 3,4-4,5 весАнализ показывает, что благодаря диаконцентрационной ступени все фракции, составляющие кровь с молекулярным весом, меньшим 10.000, из концентрата удаляют. К ним принадлежат фракции, которые нежелательны для консервирования, например олигопептиды 20 с вазоактивным действием.После этого для окончательного удаления примесей, а также электролитического установления диализа, обработку ведут трехкратным раствором, 0,9-ного МаС 3. Диализ проводят в одинаковых аппаратах с одинаковыми мембранами, которые применяют при концентрировании.Последующее концентрирование заканчивают установлением концентрации протеина 6-10. После этого с помощью раствора МаС 3 устанавливают физиологические условия изотонии, присущие человеческой крови, и общая концентрация протеинов становится равной 5Анализ полученных в примере 1 протеинов показал следующие значения, мг:(содержание в 100 мл) 40Протеин 5.000Альбумин 2.92519 М 1.50019 А 38019 М 285 45Полученный раствор фильтруют дополнительно через стерилизующие фильтры. Благодаря мембранным фильтрам происходит стерильная фильтрация.После этого препарат готов для внутривенной инъекции.П р и м е р 2. В 300 л раствора, как и в примере 1, растворяют, 1 р:7,5 СОНМ фракции 1.Ч4 СОНМ фракции11-18 СОНМ фракции 11 Состав этих фракций соответствует . примеру 1Фракции перемешивают с растворителем, значение рН поддерживают 4,6. В раствор добавляют 60 г на литр аэрозила И значение рН уста навливают равным 7,6 и смешивают при температуре 47 С в течение 4 часов Ф после этого раствор охлаждают до 18 С и гидравлически фильтруют. Гидравлическую фильтрацию производят в намыв ных фильтрах, тип СНЕ. В качествефильтровального средства используютНуГ Ро 5 орег Се г, 8-ной концентрациина общее количество фильтрата. В качестве фильтровального средства мож"но применять также кизельгур целит545 в 5-ной концентрации.П р и м е р 3. После очистки растворы разделяют и подвергают обработке способом диаконцентрирования,как впримере 1. Их можно при желании обрабатывать до получения конечногоконцентрата по способу, описанномув примере 1,и после этого по выборусоединять в любой состав.П р и м е р 4. В 200 л фосфатноцитратного буферного раствора (0,66моль фосфат-цитрата) растворяют10 Мр фракции 111 в течение 3 часов.Значение рН устанавливают 7,5 и после последующего разбавления в 300 лперемешивают с упомянутым буфернымраствором при добавлении 100 г/лаэрозил/бентонита (2;1) в течение4 часов при 45 С. После охлаждениядо 10 ОС суспензию фильтруют на намавном фильтре через фильтрат, в качестве которого применяют кизельцелт .545, количество которого на1 м фильтровальной поверхности составляет 1,0 к, причем мощностьфильтра 50 л/м час. Фильтрацияпроисходит как и диаконцентрирование в примерах 1-3. Раствор готовогоконечного концентрата содержит 5белка. При этом средний состав следующий, мг:Протеин 5000Альбумин Около 1300-2000Глобулин 3000-320019 Около 1.45019 А Около 7009 И Около 500П р и м е р 5. СОНМ фракции 1 в 1и 1 Чс концентрацией этанола 40и со значением рН 5,8 выделяют вступени. Под фракцией 1 Чследуетпонимать фракцию, идентичную фракции 1 ч,Осадок изолируют 20 кг преципитата, как и в примере 1 погружают в300 л растворителя и далее обрабатывают.П р и м е р б. Фракционированиечеловеческой плазмы производят с.помощью риванола (2-этокси-б,9-диамино-ацидинилацетат), при этом выпадают осадки 11, 111 и 1 У. Этиосадки можно по предлагаемому способу обрабатывать до получения препарата белковой сыворотки. По 10 1 ркаждого осадка, т.е. вместе это составляет 30 1 р, вносят в 300 л растворителя,как и в примере 1. Дальнейшую обработку производят также,как и в примере 1.П р и м е р 7. В 200 л раствораповаренной соли (дистиллированнаявода с 1,7 вес. МаС 9, у которой ве786354 формула изобретения Составитель С. Малютина Редактор В. Смирягина Техред Т.Маточка . Корректор О. КовинскаяЗаказ 8872/63. Тираж 673 Подписное ВНИИПИ Гооударственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 личина рН при помощи 0,2 н. НСР установлена в 4,6 и которая ниже называется растворителем) добавляют 6,0 1 ср СОНМ Фракции 1 Ч со следующим анадизом компонентов белка и суспендируют, вес.В:Ьльбумина 53А 1-Глобулина 11-Глобулина 8-Глобулина 14Гаммаглобулина 14Затем добавляют 4,0 1 ср СОНМ подфракций 111 со следующим анализом белковых компонентов, вес,ЪЬльбумина . 71-Глобулина 3А-Глобулина 9Ь -Глобулина 26Гаммаглобулина 56Соотношение остаточной влажности (Н О, остаточный этанол) и твердых веществ (белки, соли) составляют около 1:1.10 Мр влажной фракции суспендируют в растворителе и размешйвают. При этом величину рН поддерживаютпостоянно 4, 6. Следующие стадии протекают, как описано в примере 1 (центрифугирование; обработка кремневой кислотой, фильтрование на активном угле, концентрирование диализом),На 100 мл раствора при 5.000 мг установленного содержания протеина получают около 37 альбумина, соответственно 1850 мг, около 63 глобулинов, соответственно 3150 мг, содержание иммунных, глобулинов, мг:198 Около 1.4509 АОколо 7009" Около 500Предлагаемый способ позволяетполучить препарат на основе белковой сыворотки с повышенным содержа-нием иммуноглобулина. Способ получения препарата на ос- И нове белковой сыворотки путем Фракционирования плазмы с последующейадсорбцией, очисткой и стерилизацией,о т л и ч а ю щ и й с я тем,.что,с целью повышение содержания иммуно глобулина, плазму освобождают от продуктов коагуляции, Фракционируют поспособу Кона, из полученной послеФракционирования Фракции 11 выделяютФракции 111-1 и 11-11, последние д смешивают с Фракцией. 1 Ч и суспендируют смесь в Физиологическом растворе. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, И.Я 1 ерйап - Чох Ьапды щ, 442457, 1975.