Способ определения активности х пролилдипептидиламинопептидазы

Союз Советскик Социалистических республик(51)М, Кл,зА 61 В 10/00 .О 01 й 33/48 Государственный комитет СССР оо делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения ИностранцыТосихару Нагацу и Сумпеи Сакакибара (Япония ) Иностранная фирмаийдзиномото Ко.,Инк,",(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ Х-ПРОЛИЛДИПЕПТИДИЛАМИНОПЕПТИДЪЗЫ Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано при диагностике некоторых заболеваний.Предлагаемый способ в патентнойи научно-технической литературе не описан.Целью изобретения является определение активности Х-пролилдипептидиламинопептидазы. 10Эта цель достигается тем, что фермент инкубируют с субстратом об" щей формулы Хпролин-т или его кислой солью при температуре от 30 до 45 о С в водной среде при рН 6-9 .и определяют количество высвободившегося вещества формулы У-Н, где Х - остаток глицина, (.-аланина, (.-глутаминовой кислоты, -аспарагиновой кислоты, "лизина, -аргинина; т - 20 остаток п-нитроанилина, н-фенилазоанилина или 4 фенилазо-нафтиламина.Кроме того, в качестве кислой соли используют соль соляной кислоты, бромистоводородной кислоты или и-то луолсульфокислоты.Остаток Н-конечной аминокислоты (Х) дипептидных .производных, Хпролина-т включает любой аминокислотный остаток, так как фермент специФичен 30г 2по отношению ко второму аминокислот- ному остатку, остатку -пролина, а не к остатку й-концевой аминокислоты. й-концевую аминокислоту обычно выбирают из (.-аминокйслот, содержащих до 15 атомов углерода, и существующих в протеине, например в нейтральных аминокислотах, таких как .глицин, алании, валин, лейцин, серии, треонин, фенилаланин, триозин и триптофан; основных аминокислотах, таких как лизин и аргинин. Эти аминокислоты могут.обладать любой стереохимической конфигурацией ( О и (.О), если они содержат асимметричный углеродный атом; однако обчыно они имеют Е форму. Кроме тогоэти дипептидные производные используют в качестве суб-. стратов не только в свободной форме, но также в форме солей тех кислот, которые не ингибируют активность фермента, таких как н-толуолсульфоновая кислота, хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота. Так:как соли более стабильны, чем сами дипептидные производные, они и являются более предпочтительными в ка" честве субстратов.Часть У Хпролина-У выбирают из группы, состоящей из групп н-нитро2 3 20 80, 94+3,87 Еаг 1 у еььепс 1 а 1пуРег репопР 1 хед езьепй 1 а 1 Р0,001 пурегепь 1 опСаясг 1 с Сапсег 89,29+3,6938,4+2,339,8+2,638,8+11,936,3+5,631,0+9 5 Р ( 0,001 Р ( 0,001 Р С 0,001 Р ( 0,01 Р (0,01 37 Рц 1 щопагу Сапсег 17Асцсе 1 ущрЬосус 1 е1 ец 1 сеа 1 а 22 1.уарЬоьагсова 11 Нод 911 п 1 ь д 1 ьеаье 15 Р (0,01 Нормальная (контроль)ГепатитыРано выявленная гипертонияХроническая гипертонияРак желудкаРак легкихОстрая форма лейкемии 25 исло слу- чаев ктивность фермента Группа Е-А 1 а(сокращения С 1 у, Е-А 1 а, Е-Аьр,Е-С 1 ц, Ь-Ьуз и Е-Агд в таблице означают группу Х-и-нитроанилида Х-(.- 40-пролина),П р и м е р 31. 0,23 мг кристаллического тозилата и-нитроанилидаглицил.-пролина растворяют в 100 млводы при помешивании. Для хорошего 4растворения понадобилось 30 мин при20 еС или 18 мин при 30 фС.С другой стороны, 0,23 мг пористого тоэилата и-нитроанилида глицил-Е-пролина, который получают при Язамораживании 15 ми водного растворатозилата и-нитроанилида глицил.пролина при -40 ОС и последующем высушивании замороженного вещества при0,05 лм рт.ст. растворяют в 100 мл рводы при помешивании, как и в предыдущей процедуре. Для хорошего растворения понадобилось всЕго лишь 10 спри 20 С и 5 с при 30 С.Предлагаемый способ позволяет определить активность Х-пролилдипепти- ЮО ЛимфосаркомаБолезнь ХодкинаП р и м е р 30. Была измерена активность Х-пролилдипептидиламинопептидазы по методике примера 22,причем, в качестве субстратов использовали различные Х-Е-пролил-п-нитроанилиды, а в качестве источника фермента - человеческие сыворотки от пациентовРезультаты приведены в табл. 6Таблицаб,диламенопептидазы, что имеет важноезначение для диагностики различныхзаболеваний. Формула изобретения г1. Способ определения активности Х-пролилдипептидиламинопептидазы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что фермент инкубируют с субстратом общей формулы Х-Е-пролин-ц или его кислой солью при температуре от 30 до 45 фС в водной среде при рН 6-9 и определяют количество высвободившегосе вещества формулы У-Н, где Х - остаток глицина, Е-аланина, Е-глутаминовой кислоты, 1.-аспарагиновой кислоты, (.-лизина, (.-аргинина, У - остаток п-нитроанилина, и"фенилаэоанилина, или 4-фенилазо-нафтиламина.2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве кислой соли используют соль соляной кислоты, бромистоводородной кислоты или и-толуолсульфокислоты.анилина, и-Фенилаэоаннлина и 4-Фенилазо-нафтиламина, Предпочтительнымявляется остаток п-нитроанилина, таккак содержащее его дипептидное производное лучше всего растворяется вводе, наиболее стабильно и синтезировать его проще всего.3Активность фермента по отношениюк новым дипептидным производнымХпролин-У различна в зависимостиот того, какова крупна М-конечнойаминокислоты (Х). Дипептидные производные, содержащие нейтральную илиосновную аминогруппу в качестве Х,наиболее легко гидролизуются ферментом, а те, которые содержат кислотную аминогруппу, наиболее слабо.13Дипептидные производные, содержащиенейтральную или основную аминокислотную группу, или их соли, такихкислот как и-толуолсульфоновая кислота, подходят в качестве субстратов, 26но производные основных аминокислотгигроскопичны. Дипептидные производные, содержащие группу глицина,отличаются самой большой скоростьюгидрслиза при рН 8,7 из различныхрдипептидных производных Х.-проли-,на-У; в темноте они обладают высокойстабильностью и легко растворяютсяв воде. Производные глицина, особенноего соль такой кислоты, как хлористо- З 0водородная и п-толуолсульфоновая, негигроскопичны по сравнению с производными основных аминокислот и удобныпри анализе. П-нитроанилид глицилпролина или его соли, особенно и-толуолсульфонат (тоэилат), являютсянаилучшими субстратами,Если используемая аминокислота содержит боковые функциональные группы, то они могут быть использованы 40 после того, как Функциональные группы будут защищены. Например, в случае кислых аминокислот, их используют после того, как боковые карбоксильные группы превращают в сложные эфи ры, такие как бензиловый эфир. Аргинин используют после того, как группу гуанидина защищают обычной защитной группой, такой как тозил, нитро-, и-нитро-бензил-карбонил и 50 2-(изопропилоксикарбонил)3,4,5,б-тетрахлор-бенэоил, и особенно двумя первыми группами, тогда как М-аминогруппу лизина обычно защищают известными аминозащищающими группами, предпочтительно теми же защитными группами, как и те, что используют дня защиты М-аминогруппы.Защитную группу М-защищенного-Х- пролина-У, полученного таким образом, затем отщепляют с помощью 60 известного способа, зависящего от природы М-защитной группы; и, если она есть, защитной группы боковых Функциональных групп. Очень важно отщепить только защитную группу, не 65 затронув остальные, в этой реакции . элиминирования.Можно также синтезировать необходимые дипептидные производные соединением вначале М-защищенного Хпролина с частью Ч, а затем отщепить защитную группу от полученного Х-С-пролина-У.Если нужно получить соли кислот дипептидных производных, то их получают при .взаимодействии дипептидных производных с кислотами в такой среде, как вода, этанол, Соли также получают из М-защищенных производных при взаимодействии их с кислотами, если защитная группа является т-бутилоксикарбонилом или аналогом, который может быть отщеплен под действием кислоты.Среди различных солей кислот тозилат является наиболее предпочтительным, так как он образует твердые кристаллы, которые не эключают примесей, присутствующих в маточном растворе, и который может быть поэтому . получен с высокой степенью чистоты . простой перекристаллизацией.Активность Фермента легко измеряется, если в качестве субстратов используют дипептидные производные или их соли. Вначале приготавливают водный раствор Хпролина-У или его соли подходящей концентрации. Если для растворения субстрата в воде требуется слишком мало времени, то предпочтительно использовать подходящие вещества для ускорения скорости растворения, такие как неионные детергенты, кислоты или спирты, или использовать субстрат в пористой форме, чего можно достичь замораживанием. Пористый субстрат наиболее удобен для рутинного анализа фермента; рН раствора субстрата меняется в зависимости от того, какой субстрат используют. рН обычно расположен в интервале от б до 9, и предпочтительно от 7,5 до 8,9. Субстраты спонтанно гидролизуются при рН свыше 9,5, но расторы .субстрата, особенно раствор и-нитроанилида глицилпролина, стабилен при вышеупомянутом оптимуме рН и может храниться при 1 фС свыше недели без заметного разложенияАктивность Фермента измеряют при контакте субстрата с Х-пролил-диаминопептидазой или образцом, содержащим ее, в водной среде, предпочтительно в буферном растворе, таком как трималеат буфер, глицин-МаОН буфер и амидиол буфер при температуре от 30 до 45 фС в течение определенного промежутка времени, определяя фермент обычным способом, и затем определяют освобожденные У-Н. Инкубационный период определяют в с. ответствии с количеством субстрата и Фермента. Даже если сырой фермент, такой как сыворотка человек, используют в качестве источника Фермента,то активность измеряют достаточноточно, так как субстрат практнческине гидролизуется другими ферментами,сопровождающими сырой Фермент,Количество освобожденных У-Н легко определяют, измеряя поглощение ферментной, реакционной смеси непосредственно на длине волны, соответствующей индивидуальной группе У-Н аименйо при 385 нм для и-нитроанилина,493 нм для и-Фенилазоанилина и 532 нмдля 4-фенилазо-нафтиламина. Прямойфотометрический метод прост, удобен иточен и, таким образом, подходит длярутинного анализа активности фермен"та. 15Когда У-Н группой является и-нитроанилин, активность Фермента можноопределять диазотизицией и-нитроанилина, осуществляемой за счет избытка нитрата натрия в кислой среде, ;щПри этом измерении количество и-нитроанилина, который образовался, может быть рассчитано измерением непрореагировавшего нитрата натрия; однако обычно определяется так называемым способом азосоединения, разлагаянепрореагировавший нитрит натрия сульФаминовой кислотой сульфатом аююиия, мочевиной и т.д., подвергаявзаимодействию образовавшийся и-нитрофенилдиазониум с соединяющим компонентом, таким как (- 1-иафтил) этилендиамин, и затем измеряя поглощение образовавшегося азосоединенияна длине волны, характеризующей этоазосоединение. Этот косвенный метод З 5определения более сложен, чем предыдущий прямой Фотометрический способ,но более чувствителен.Приведенные далее примеры иллюстрируют изобретение более подробно. ЩП р и м е р 1. и-НитроанилидИ-бензилоксикарбонил пролииа.Треххлористый фосфорил (50,6 г)медленно размещают в растворе й-бензилоксикарбонилпролина (74,8 г) 4и и-нитроанилина (41,4 г) в тетрагидрофуране (400 мл) при -10 фс. Всмесь по каплям добавляют триэтиламин(92,4 мл), причем температуру внутриподдерживают при -15 фС. Триэтиламиндобавляют до рН 7, после чего температуру реакционной смеси повышаютдо комнатной и перемешивают смесь, втечение 3 ч.Растворитель заменяют этилацетатом (1,2 л), раствор послед-вательно 55промывают водой (100 мл), 1 н. соляной кислотой (300 мл х 5), водой(400 мл), 5 Ъ-ным раствором гидрокарбоната (300 мл х 3) и насыщеннымраствором хлористого натрия (300 мл)и сушат над сульфатом магния. Высушенный раствор концентрируют при пониженном давлении, остаток кристаллизуют, добавляя этиловый эфир, иполученный продукт перекристалли- д зовывают из смеси этилацетата (300 мл)и метанола (50 мл), выход 56 г,т. пл. 159-161 С, д.1. 107, бф(С=1,0метанол),Найдено, Ъ: С 62,07; Н 5,20;й 11,62.СН,О,И,Вычислено, Ъ: С 61,77; Н 5,19;й 11,38.П р и м е р 2. Бромгидрат и-нитроанилида (.-пролина.и-Нитроанилин й-бензилоксикарбонилпролина (55,4 г), растворяютв 26%-ном растворе безводного бромистого водорода в уксусной кислоте(200 мл) при ОоС, и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Раствор примешивают в су"хой этиловый эфир (2 л) для кристаллизации продукта, который выделяютдекантацией, отмывают этиловым эфиром и сушат, выход 47 г.Неочииенный продукт используют вследующих примерах без дальнейшейочистки. Пробу для анализа получаютперекристаллизацией из смеси метанола с этиловым эфиром.Т.пл. 225-226 ОС, 22 35,бф(С=1,0,СИОН).Найдено, Ъ: С 41,75; Н 4,34;й 13,30.С 44 н 4+Озй ЬвгВычислено, Ъ: С 41,79; Н 4,46;й 13,29.П р и м е р 3. п-Нитроанилидй-бензилоксикарбонил-глицилпролина.й-бензилоксикарбонил-глициновыйоксисукцинимидный сложный эфир (48 г,0,16 моль) перемешивают в охлажденную смесь бромгидрата и-нитроанилида -пролииа (47 г, 0,15 моль), триэтиламина (22 мл) и й-оксибензтриазола (1 г) в диметилформамиде (100 мл),Всю смесь перемешивают при комнатнойтемпературе в течение 1 ч, поддерживая в течение этого врейени рН раствора 8 с помощью триэтиламина, азатем раствор перемешивают еще в течение 19 ч при комнатной температуре.Растворитель удаляют испарениемпри пониженном давлении, в остатокдобавляют .воду (350 мл), а затемпродукт дважды экстрагируют этилацетатом (500 мл, 200 мл). Экстрактысмешивают, последовательно отмываютводой (200 мл), 1 н. соляной кислотой (200 мл х 2), водой (200 мл) и5%-ным раствором гидрокарбонатанатрия (200 мл х 4) и водой (200 мл)и сушат над сульфатом магния, выход67 г.Гомогенность этого продукта былаподтверждена методом тонкослойнойгазовой хроматографии на силикагелес использованием в качестве растворителя смеси хлороформа, метанола иуксусной кислоты объемное отношеиае (95:5:3).эуют из небольшого количестова воды,выход 5,2 г,пл. 144-145 С (с раз-.ложением,Щ - 100,3 С(С=1, О 1 й-НС , а 12170 (0,1 И-НС 1) .Найдено, Вз С 48,03; Н 5,63;й 14,16.С 1 Н 18 Оь На 3/2 Н 1 ОВычислено," Ъ: С 47,74; Н 5,61;й 14,85.П р н м е р 1.0. и-Нитроанилидт-бутилоксикарбоннл-Эф-бензилглутамилпролина.1 ОБромгндрат и-нитроанилида -пролина (9,5 г) и т-бутилоксикарбонил-уф-бензил-;глютаминовую кислоту, выделенную из дициклогекснламиновой соли(17,1 г), присоединяют с помощью (5й,й -дициклогексилкарбодинмида, какв примере 6. Сырой продукт очищаютна хроматографической колонке до получения аморфного твердого вещества,выход 12;7 г. 20Гемогенность твердого веществабыла подтверждена с помощью тонкослойной хроматографии,П р и м е р 11. и-Нитроанилид(.-глутамилпролина. 25и-Нитроанилид т-бутилоксикарбонкл-ф"-бензилглютамилпролина (10 г,0,018 моль) обрабатывают Фтористымводородом (около 50 мл) и реакционную смесь обрабатывают как в примере 9. Конечный продукт получен в ви- ффде кристаллов, выход 4 7, т. пл. 117126 ос (с разложением),уф - 82,8 Спролнна.Бромгидрат и-ннтроанилида -пролина (9,5 г) соединяют с И,йф-дибенэилоксикарбонил-(.-лизином (12,4 г) иреакционную смесь обрабатывают, какв примере 6. Конечный продукт.получают в виде аморфного твердого вещества, выход 15,8 г.Гемогенность продукта была подтверждена с помощьв тонкослойнойхроматографии.П р и и е р 13. Дитолизат и-иитроанилида (.-лизки-пролива.и-Нитроанклид Иф,йф-дибенэилоксккарбонил-(.-лизил-Е-пролина (9,5 г)обрабатывают 26-ным раствором без Иводного бромистого водорода в уксусной кислоте (35 мл) и реакционнуюсмесь обрабатывают по методике примера 2, Таким образом получают дибромгидрат и-нитроанилида (.-лкэилпролина, выход 7,8 гБромгидрат растворяют в 0,1 М уксусной кислоте, раствор пропускаютчерез колонку Амберлита 1 к(вформе эцетата, 200 мл),которую промывали О, 1 М уксусной кислотой. Элюат и промывки соединяют и выпаривают до остатка при пониженном давлении; затем остаток растворяют в смеси этанола с моногидратом и-толуолсульфоновой кислоты (5,5 г. Концентрирование раствора при пониженном давлении дает остаток, который крнсталлнзуют, растирая его с этиловые эиром, выход 10,1 г, у. пл. 92-130 С (с разложением), Щ - 32,6 С (С=1,1, водаНайдено, Ъ: С 49,76; Н 6,02;й 9,26С 1 НМ 01 о Не 2Вычислено, Ъ С 50,05; Н 6,11;й 9,42П р н м е р 14. и-Ннтроанилид й -бЕнзилоксикарбонил-й -тознл-(.-аргинид-ь-пролина.Бромгидрат и-нитроанилкда -проли" на (12,0 г) и й-бенэилоксикарбонил-, й -тозиларгинин, который выделяют нэ соли циклогексиламида (23 г), рас" творяют в хлороформе (60 мл) и в раствор примешивают 1-этил-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (6,8 мл) при ОЕС. Смесь перемешивают еще в течение 17 ч при комнатной температуре и далее обрабатывают, как в .примере 3, выход 22,3 г. Гомогенность этого продукта подтверждена с помощью тонкослойнойхроматографии.П р к м е р 15. Дитозилат и-нитроанилида (.-аргинкнпролива.и-Нитроанилкд й-бенэилоксикарбо-.нил-й -тозиларгинилпролинав(8,2 г) обрабатывают безводным фтористым водородом, как в примере 9.После удаления избытка Фтористоговодорода остаток обрабатывают, какв примере 13. Конечный продуктполучен в виде кристалла, выход 7,3,т. пл. 125-138 оС (с разложением,93 -31,4 С (С=1,0, вода),Найдено, Ъ С 47,79; Н 5,83;И 12 ю 53С 34 Н,О, Из 5/2 НОВычислено, В: С 47,67; Н 5,85;И 12,56.П р к м е р 16. и-фенилазоанилкдИ-бензилоксккарбонил-Е-пролнка.и-фенилазоанилин (7,9 г) и й-бензклоксккарбонклпролин-(10,0 г)соединяют и реакционную смесь обрабатывают, как в примере б, В результате получают твердый продукт, вы- .ход 10,8.Этот продукт используют в следующем примере 17 беэ дальнейней очистки. Образец для анализа получаютрекрксталлиэацией из н-гексанэтилацетата. хеТ. пл. 141-143 бС Ы - 87 0 СВычислено, : С 70,07; Н 5,65;13,08П р и м е р 17, д-Фенилазоанилидй-т-бутилоксикарбонил-глицилпролина.и-Фенилаэоанилид й-бензилоксикарбонилпролина (4,3 г 0,01 моль)обрабатывают 25-ным раствором безводного бромистого водорода в уксусной кислоте (35 мл) и реакционнуюсмесь обрабатыварт, как в примере 2.Бромгидрат и-Фенилазоанилида-пролина, полученный таким образом,и т-бутилоксикарбонилглицин (2,5 г)соединяют, как в примере б. Сыройпродукт, полученный при этом, очищают на хроматографической колонке;после очистки получают конечный продукт в виде кристаллов, выход 3,4 г,т. пл. 172-17 боС, ГоЦо,1 С.(С=1,0, диметилформайид).Найдено, : С 64,08; Н 6,73;й 15,18Сж Н 9 ОМВычислено, : С 63,84; Н 6,47;й 15,51,ь П р и м е р 18. Тозилат и-фенилазоанилида глицин -пролина и-Фенилазоанилид т-бутилоксикарбонил-глицил-Е-пролина (2,5 г) растворяют в уксусной кислоте (8 мл) вместе с моногидратом в-толуолсульфоновой кислоты (2,3 г). Смесь перемешивают прикомнатной температуре в течение 2 ч.Продукт осаждают, добавляя в реакционную смесь этиловый эфир, выделяют фильтрованием и отмывают этиловым эфиром. Полученный твердый продукт дважды перекристаллиэовываютиз смеси этанола с этиловым эфиром,выход 1,6 г, т. 1 л. 141-155 С (сразложением), Щ68,7 С (С=1,диметилформамид),б фф 25000(0,1 н.соляная кислота),Найдено, : С 57,53; Н 5,60й 12,99СЩ Н 28 06 йВычислено, : С 57,65; Н 5,77;й 12,93,П р и м е р 19. 4-фенилазо-нафтиламид й-бензилоксикарбонилпролина,4-Фенилазо-нафтиламин (4,9 г)и М-бензилоксикарбонилпролин(5,0 г) соединяют и затем реакционную смесь обрабатывают,как в примере 6. Конечный продукт получают ввиде кристаллов, выход 3,5 г. т,пл,136-138 С, ГАЗ , -75,9 С (С=1,0, ди;метилформамид),Найдено, : С 72,68; Н 5,57;й 11,93С 9 Н 9 Ой.Вычислено, : С 72,78; Н 5,48;М 11,71,П р и м е р 204-Фенилазо-наф,тиламид-т-бутилоксикарбонил-глицил-,пролина. 4-Фенилазо-нафтиламид-М-бензилоксикарбонилпролива (2,5 г) обрабатывают 25-ным раствором безводного бромистого водорода и уксусной кислоте (25 мл) и реакционную смесь обрабатывают,как в примере 2,Вромгидрат 4-фенилазо-нафтиламида Е-пролива, полученный таким обра, зом, и т-бутилоксикарбон -глицин(1,36 г) соединяют с М, й -дицикло гексилкарбодимидом и реакционнуюсмесь обрабатывают, как в примере б,Сырой продукт очищают затем на хроматографической колонке, после чегоконечный продукт получают в кристаллическом виде, выход 1,1 г.На тонкослойной хроматограмме этотпродукт проявился в виде одиночногопятна.П р и м е р 21, 4-Фенилазо-нафтиламид глицил-б-пролина,29 4-Фенилазо-нафтиламид т-бутилокси-глицил"-пролина (1,0 г) обрабатывают моногидратом н-толуолсульфоновой кислоты (0,76 г) и реакционнуюсмесь обрабатывают, как в примере 17.Тозилат 4-фенилазо-нафтиламидаглицилпролина, полученный таким образом, растворяют в метаноле и нейтрализуют 5-ным раствором гидрокарбоната натрия для высаждения продукта,Высаженный из раствора продукт выделяют фильтрованием, отмывают водой,сушат и перекристаллизовывают иэсмеси метанола с водой, выход 0,67 г,т. пл. 127-138 оС (с разложением),ГАЗА - 87,7 С С=1, днметилформа 35376мнд), й , , 14.400 (0,1 н. солянаякислота),Найдено, : С 66,45; Н 5,81;й 16,69С 2 ЪН 1302 МЗ 34 НХО40 Вычислено. : С 66,56; Н 5,95;М 16,88П р и м е р 22. Изучают связьмежду инкубационным периодом и количеством гидролизованного субстрата, используя и-нитроанилид глицил-(.-пролина и сыворотку человека в качестве субстрата и источника фермента соответственно, и пробу гйдролизованного субстрата отбирают для последующего прямого фотометрического измерения.Тозилат и-нитроанилида глицилпролина растворяют в 2-ном водном растворе неполного детергента (М 11 о 1 МР, МКо, СЬеаса, Оьаса, 4 арап) в концентрации 3 мм для получения раствора субстрата. Затем приготовляют следующие 4 пробирки:экспериментальная пробирка, содержащая 0,5 мл 0,15 М глицин-йаОНв качестве буфера (рН 8,7) 0,5 млраствора субстрата и 0,5 мл человеческой сыворотки;пробирка, содержащая 0,5 мл 0,15 г.глицин-йаОН в качестве буфера 0,5 м:раствора субстрата и 0,05 мл воды;Таблица 1 15 18,1135,43 71,65 100,79 135,43 30 60 90 120 Результаты этих испытаний подтверждают, что реакция ферментации линейно зависит от времени.Ту же самую процедуру повторяют с той разницей, что вместо человеческой сыворотки используют гомогенный фермент, выделенный препаративно из подчелюстной железы человека.П р и м е р 23Зависимость между количеством фермента и количеством гидролизованного субстрата изучают на тозилате и-нитроанилида глицил-Е- -пролина и человеческой сыворотке, которые используют в качестве субстрата и источника фермента .;оответственно, и пробу на гидролизуемость субстрата осуществляют по следующим азосочетаниям.Приготовляют следующие пробирки:экспериментальная пробирка; содержащая 1,0 мл 0,15 М глицин-йаОН в качестве буфера (рН 8,7), 1,0 мл раствора субстрата, приготовленного в примере 21, и человеческую сыворотку в объеме, укаэанном в табл.2,50 14,24 32,91 45,89 62,50 82,44 155,06 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,10 Результаты этих испытаний подтверждают, что реакция ферментации линейно зависит от количества ферд мента. эталонная пробирка, содержащая 0,5 мл буфера, 0,5 мл субстрата и 0,5 мл водного раствора и-нитроанилина;контрольная пробирка, содержащая 0,5 мл буфера и 0,5 мл субстрата.Все пробирки инкубируют при 37 .С в теченце времени, указанного в табл.1, и затем реакцию останавли,вают добавлением 3,0 мл 1 М ацетата в качестве буфера (рН 4,2) в каждую пробирку, В контрольную пробиркУ добавляют 0,05 мл человеческой сыворотки после остановки реакции. Фотометр устанавливают на нуль с помощью хо" лостой пробирки, а затем измеряют поглощение экспериментальной (Э), контрольной (К) и стандартной (С) пробирок на длине волны 385 мл в кювете толщиной 1 см. Количество и-нитроанилина, освобожденного в реакции с ферментом, рассчитывают по уравнениюЕ-с-- 150 (н моль).Результаты приведены в табл,1. Инкубационный Количество образо- период, мин вавшегося и-нитроанилина, и-моль контроЛьная пробирка, содержащая1,0 мл глицин-МаОН в качестве буфераи 1,0 мл раствора субстрата.Обе пробирки, как экспериментальную, так и контрольную, инкубируютпри 37"С в течение 30 мин, а затемдобавляют 0,1 мл человеческой сыворотки в контрольную пробирку, Реакцию останавливают добавляя 0,4 мл30-ного водного раствора хлорнойкислотыПосле центрифугирования со скоростью 3000 об/мин в течение 10 минкаждые 0,5 мл надосадочной жидкостипереносят в другую пробирку, крометого 0,1 мл водного раствора и-нит роанилина и 2,4 мл 30-ного раствора хлорной кислоты добавляют в эталонную пробирку, а 2,5 мл растворахлорной кислоты - в холостую пробирку.20 Во все четыре пробирки добавляютпо 0,5 мл 0,2-ного водного растворанитрита натрия при 4 С и при этойтемпературе их выдерживают в течение 10 мин. Затем добавляют 0,5 млсвежеприготовленного 0,5-ного водного раствора сульфата аммония. Через 2 мин добавляют 1,0 мл 0,05 ного раствора й-(1-нафтил)-этилендиамина и пробирки инкубируют при37 С в течение 30 мин в темноте.Фотометр устанавливают на нуль спомощью холостой пробирки, измеряютпоглощение экспериментальной (Э),контрольной (К) и стандартной (С)пробирок при 548 нм.З 5 Количество П-нитроанилина, образовавшегося с помощью фермента, рассчитывают по уравнению(Е - с) х 500 А 2,50,5 ф 0 где А есть объем 0,5 мМ водного раствора и-нитроанилина, использованного в стандартной пробирке (мл).Результаты приведены в табл. 2.Таблица 2 Объем сыворотки, Количество образовавшегося и-нитроанилина, и-моль86853 15 16 Субстрат Оптимум рН рН 7 0 Человеческая сывороткарН 8,7 Очищенный Фермент подчелюстной железы че- ловека Человеческая сывороткарН 7,0 и-Нитроанилидлизид,-пролина 8,5-8,7 1,2 х 10 122 71 121 и-Нитроанилид.-аргининпролина 7,8-8,0 2,3 х 10" 94 55 и-Нитроанилид-глицил.-пролина 8,5-8,7 3,3 х 10 100 100 100 п-Нитроанилид-Е-аланилнролина 8,5-8,7 1,4 х 1075 86 83 и-Нитроанилид.-глутамил.-пролина 8,5-8,7 2,3 х 10 а 58 37 54 и-Нитроанилидаспаргил.-пролина 8, 5-8, 7 8,1 х 10 37 28 П р и м е р 24. 3 мМ раствора субстратов приготавливают, как в примере 2, причем в качестве субстратов используют различные дипептидные производные или их соли, Лктивности фермента по отношению к различным субИзмеряют активности очищенногофермента подчелюстной железы человека в 0,15 М трисмалеат буфере срН 5,6-8,8 и в 0,15 М глицин-йаОНбуфере с рН 8,2-0,4. Для п-нитроанилида -аланилпролива в качестве 40буфера вместо глицина используютиндол, так как глицин затрудняетфотометрирование при значениях рН9"10.Значения Км измеряют для трисмале-ат буфера с рй 7,0 с применениемФермента подчелюстной железы человека. Приведенные значения являютсясредними из повторных экспериментов.Измеряют активности при рН 7,0 в0,15 М трисмалеат буфере или прирН в 0,15 М глицин-ИаОН буфере, Приведенные значения являются среднимииз повторных экспериментов.Очищенный Фермент получают следующим способом. Фермент переводятв растворимое состояние из микросоматической фракции автодигерированиеми последовательно очищают фракционированием с помощью (йн 4)50 с последующей очисткой БерЬадех 6-200 60хроматографией.Субстрат используют в виде дитозилата.Субстрат используют в виде хлор, гидрата. 65 стратам, скорости гидролиэа и оптимальные значения рН различных субстратон с помощью фермента иэмеряют,как в примере 22. Результаты приведены в табл. 3.Таблица 3 Относительная активность Фермента ВП р и м е р 25. Продукты, полученные после инкубирования в течение 30 мин различных и-нитроанилидов Хпролинов с очищенным ферментом подчелюстной железы человека или с ,человеческой сывороткой, как в примере 22, используют с помощью бумажной хроматографии, причем в качестве й-конечных аминокислот (Х) используют остатки глицина, -аланина, -глутаминовой кислоты, 1.-аспаргиловой кислоты, 1.-лизина и -аргинина.В этом случае, когда используют очищенный фермент, на хроматограмме идентифицируют кроме субстрата только Х;-пролин и п-нитроанилид, а Х-ОН, -пролин или п-нитроанилид -пролина не наблюдались.В этом случае, когда в качестве фермента используют человеческую сыворотку, а в качестве субстрата о-нитроанилид - глицил-пролина, на хроматограмме идентифицируют глицил- -1.-пролин-глицин, -пролин и и-. нитроанилид, а и-нитроанилид 1.-пролина обнаружен не был, При исследовании скорости гидролиэа и-нитроанилида -пролина человеческой сывороткой обнаружено, что гидролизу подверглось всего лишь 0,7 и-нитроанилида глицил.-пролина. Выло показано, что человеческая сыворотка гидролизует17 786853 18 глицин-Е-пролин иэ глицина и -пропина. Эти результаты показывают, что глицил-(.-пролин может быть гидролиэован предпочтительно Х-пролилдипептидиламинопептидавой, содержащейся в сыворотке человека, с получением вначале и-нитроанилида и глицил.- -пролина, который далее гидролизувтся до глицина и -пролина другим Ферментом в человеческой сыворотке.П р и м е р 26. 3 мМ раствора субстрата приготавливают, как в примере 22, причем в качестве субстрата используют тоэилат и-фенилазоанилида глицил-(.-пролина и 4-фенилаэо-нафгаламид глицил.-пролина,Испытание активности фермента осуществляют, добавляя 0,05 мл человеческой сыворотки в смесь 0,5 мл 1,5 мМ буфера глицин-МаОН (рН 8,7) и 0,5 мл субстрата раствора в экспериментальной пробирке, выдерживая полученный раствор в течение 30 мин при 37 оС и останавливая затем реакцию добавлением 3,0 мл 1 н. соляной кислоты, Поглощение п-фенилазоанилиЧислообследованных Возраст, Средняя активность фермента годы л-моль/мин на 1 сыворотки Группа 53 15-81 20-76 15-4015-40 20-40 41-81 41-81 48-76 35 42 24 18 17 П р и м е р 29. Была измерена активность Х-пролилдипептидиламинопеп тидаэы, как в примере 22, с использованием и-нитроанилида глицил.-пролина и человеческой сыворотки в качестве субстрата и фермента соответ,ственно.Результаты приведены в табл. 5. Значения активности у молодых мужчин (не старше 40 лет) были значигельно выше, чем у молодых женщин,с 0,001. Значения активности у пожилыхженщин были значительно выше, чем умолодых женщин, р с 0,05. Таблица 5 йогаа 1 (соойго 1)Нерас 1 сцэ 54,9+1,575,8+28,5 88 Р0,01 23 Всего Мужчины Женщины Молодые Мужчины Женщины Пожилые Мужчины Женщины да глицил.-пролина А 493 нм 0,18 идля 4 фенилазо-нафтиламида П 532 мм0,80. Эти значения сопоставимы с теми которые были получены для и-нитроанилида глицилпролина.П р и м е р 27. Была измерена ско-рость гидролиза в-фенилазоанилидаглицил.-пролина по методике примера26 с применением человеческой сыво ротки в качестве фермента. Однакохолостая пробирка содержала воду0 вместо раствора фермента, как этобыло в экспериментальной пробирке,а стандартная. пробирка содержала3 мМ раствор и-фенилаэо-анилинавместо раствора фермента в экспери 15 ментальной пробирке.В результате скорость составила18,7 г моль/мин/1 сыв,П р и м е р 28. По методике примера 22 была измерена активность Х-про 2 О пилдипептидиламинопептидаэы, в качестве Фермента испольэовали 88 и человеческую сыворотку и и-нитроанилидглицил-(.-пролина в качестве субстрата.Результаты приведены в табл.4.Таблица 4 54,88 + 1,50 56,30 + 1,90 52,49 + 2,47 54,76 + 2,07 60,10 + 2,84 а 47,59 + 2,07 55,04 + 2,23 53,18 + 2,43 Ь 58 у 16 + 4,37