Способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием

1 " ,:,.гфтно-теии,а,с,аб,;ноте ОП ИСАНЙЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскик Социалистических Республик(51)М. Кл. А 61 К 35/70 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения ИностранцыКиро Асано, Цуеси Сайто, Хиромицу Танака, Сатору Эномото"Куреха Кагану Когио Кабусики Кайсян1Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности икасается получения противоопухолевых веществ.Известен способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевьмдействием, путем экстракции из грибовс последующей очисткой целевого продукта от балластных примесей 111.Однако известный способ необес" 10печивает высокой, противоопухолевойактивности полисахаридов,Целью изобретения является повышение противоопухолевой активностиполисахаридов, 15Эта цель достигается тем, что,экстракции подвергают грибы Сого 1 цв,ЬГогев Сого 1 цв сопсЬЬег,Сого 1 цвсопвогв, Сого 1 цв Ьгвцсцв, Сого 1 цв1 рагдавепцв, Сого 1 цв РцЬесепв или 20Сого 1 цв чегз 1 со 1 ог.экстракцию ведут.водой или разбавленным раствором щелочи при автоклавировании под давление в течение 5-360 мин при 150200 С. 25Кроме того, экстрагирование ведутпод давлением 5-20 кг/смз.А экстракцию .ведут разбавленнымраствором щелочи в концентрации ниже 1 н. 30 2Способ осуществляют следующимобразом,Исходный материал, грибницу илиплодовые тела базидиомицетов, принадлежащих к роду Сого 1 цв, помещаютв аппарат высокого давления, напримеравтоклав периодического действияили типа проточноГо трубчатого экстрактора, вместе с водным растворителем и материал экстрагируют в немпри температуре от 120 до 200 оС.Давление, применяемое прн этойобработке, находится на уровнеобщего давления паров водного растворителя, загруженного в сосуд. Обычнооно не выше 20 кгсм., предпочтительно менее 16 кг/дм , но должно бытьне ниже 1,8 кг/см . Время экстрагирования устанавливают от 5 до 360 мин.Проходящее время;экстрагирования выбирают в соответствии с применяемойтемпературой, которая находится вобласти от 120 до 200 оС. Если температура экстрагирования ниже 120 еС,то не обеспечивается удовлетворительный эффект экстрагирования, а еслитемпература втревышает 200 С, то может быть разложение активной составной части. Если время экстрагированинменьше 5 мин, то эффект экстрагирова 7868550 55 60 ния плохой, а период экстрагирования,превышающий 360 мин, может вызыватьразложение активной составной части.Операция экстрагирования можетбыть выполнена повторно при вышеупомянутых условиях, или исходный материал базидиомиценты) может быть погружен в водный растворитель при температуре ниже 100 фС перед операцией экстрагирования, или полученныйэкстракт может быть промыт воднымрастворителем прй температуре ниже100 фС после экстрагирования. В качестве растворителя используют чистую воду, водный кислый или щелочнойраствор, водный раствор мочевины иводный раствор аминокислоты, Наиболее предпочтительным водным растворителем является вода или разбавленный менее чем 1 н щелочной раствор.Полученный таким образом экстрактзатем очищают посредством ультра,фильтрации,высаливания,диалиэа,обратного осмоса или другими способами,которые могут применяться по отдельности или в сочетании, чтобы удалитьвещества с низким молекулярным весом(вещества с молекулярным весом менее5000) из экстракта.Такая очистка позволяет получитьазотсодержащий полисахарид с высокой противоопухолевой активностью, с вы- соким тормозящим действием против сплошного (Яо 1 Ы) рака Саркома, не только при внутрибрюшинном введении, но также и при стоматическом введении мышам.Полученные полисахариды эффективны не только для предотвращения побочных действий при химической терапии больных, пораженных опухолью и обнаруживающих повышение чувствительности к радиотерапии, но также повышают сопротивляемость против заражения вирусами или бактериями, ,когда иммунитет или физическое состояние больного слабые, стоматическое введение полисахаридов улучшает деятельность печени, улучшает аппетит, излечивает желудочные расстройства, улучшает мочеиспускание и является эффективным при лечении лепры, Способ поясняется следующими примерами.П р и м е р 1. Грибницу Сого 1 ц чегясо 1 ог (гг.) 0 ое 1, полученного искусственным разведением, высушивают до содержания воды 10 и делят на пять частей. Затем каждую часть смешивают с 12,5-кратным количеством (по весу) воды и загружают в автоклав, в котором проводят экстрагирование при условиях экстракции, показанных в табл, 1. Экстракт, полученный из каждой части, затем фильтруют, чтобы отделить раствор экстрак. та, и полученный раствор экстракта подвергают диализу при 72-часовом то ке воды при 5 С, используя диализную 5 10 И 20 25 ЗО 1 35 40 трубку в соответствии с обычным методом. Эта диалитическая обработкаустраняет из экстракта вещества снизким молекулярным весом (веществас молекулярным весом менее 5000),Диализованный раствор затем концентрируют, чтобы получить красно-коричневый порошок с содержанием водыоколо 7. Этот порошкообразный материал имеет средний молекулярныйвес более 10000. Результаты элементарного анализа и различные испытания на цветную реакцию, приведенныев табл, 2, доказывают, что это вещество представляет собой азотсодержащий полисахарид.Из результатов приведенных вышеиспытаний видно, что полученные .продукты представляют собой полисахариды, содержащие первичный пептидносвязанный азот.Для того, чтобы определить противоопухолевое действие азотсодержащих полисахаридов, полученных в соот.ветствии с настоящим изобретением,проводят следующие испытания,Опухолевые клетки Саркомыпересаживают в брюшные полости мышейи через семь дней (после остаточного размножения клеток) 10 кусочковклеток пересаживают затем другойгруппе мышей в подкожную областьподмышечной впадины для развитиятвердых опухолей. Внутрибрюшинноевведение полисахаридов начинают через 24 ч после пересадки. Веществовводят один раз в день через день вколичестве 10 мг/кг за одно введение,в общем количестве 0,2 мл/20 г (живой вес мыши), На 25-ый день послепересадки удаляют опухоль каждоймыши и определяют ее вес. Тормозящеедействие полисахаридов на рост опухолей вычисляют из среднего веса опухолей в группе мышей, которым вводили полисахариды, а среднего веса опухолей в контрольной группе. Результаты измерений представлены в табл. 3. Подробности получения соответствующих образцов, использованных в этом опыта, т.е. количество использованного водного растворителя (воды), температура и время экстрагирования, степень экстрагирования, селективность и выход также показаны в табл. 3.Из результатов, приведенных в табл. 3 видно, что в опытах, проведенных на мышах, которым были пересажены подкожно опухолевые клетки Саркомы, каждый из аэотсодержащих полисахаридов, полученных в соответствии с этим изобретением, показывает равную или более высокуюпротивоопухолевую активность по сравнению с подобными препаратами, полученными при обычных условиях экстрагирования. Выход по отношению% Содержа ние азо та,В Торможение по отношению кСаркоме,м е ч а н и е. Образец для сравнения представляет собой образец,полученный с использованием того же самого баэидиомицета, что и для образцов с 1 по 5 в соответствии сизобретением, но путем экстрагирования при нормальном давлении в соответствии с обычным методом,Степень экстрагирования представляет собой степень, растворенного гриба, использованного в качествеисходного материала, которая выражена в весСелективность представляет собой процентный выходаэотсодержащих полисахаридов с молекулярным весомсвыше 10000, полученных из экстракта.Выход по отношению к грибу представляет собой процентный выход аэотсодержащих полисахаридов с молекулярным весом свыше 10000 по отношению к общей загрузке гриба. к количеству использованного гриба заметно улучшается.П р и м е р 2. Грибницу; того же самого базидиомицета, который исполь зуют в примере 1, делят на восемь частей и каждую часть загружают в автоклав вместе с 12,5-кратным (по отношению к весу грибницы) количеством щелочного или по существу нейтрального водного раствора, описанного в табл. 3. Далее проводят экстрагирование в условиях давления и температуры, показанных в табл. 3. После экстрагирования материал в автоклаве нейтрализуют и фильтруют, чтобы,отфракционировать раствор экстракта путем отделения от нераство римых как остатка от экстракции, Этот раствор экстракта подвергают обработке методом диализа в соответствии с процедурой, описанной в примере 1, получая вещества со соедним молеку лярным весом свыше 10000. Когда эти вещества проверяют на различные цветные реакции, представленные в табл. 2, подтверждается, что они представляют собой азотсодержащие полисахариды. Чтобы определить противоопухолевую активность полученных таким образом азотсодержащих полисахаридов, образцы с 1 по 8 этих веществ вводят мышам, которым подкожно пересажена Саркома Результата показывают (см. табл.4), что эти вещества производят равное или более высокое противоопухолевое действие по сравнению с азотсодержащими полисахаридами, полученными в соответствии с обычнык методом экстрагирования горячей водой прн.нормальном давлении.Предлагаемый способ позволяет получить полисахариды с высокой противоопухолевой активностью.786855 Т а б Л И ц а 2 Цвет Примечание Цветная реакция Реакция с-нафтолом исерной кислотой (реакцияИолиша НоИ зЬ) . Пурпурный Подверждаетсахарид Реакция с индолом и сернойкислотой (реакция Диша ОзЬ) Реакция с антроном и сернойкислотой Зеленоватоголубой То же Реакция с фенолом и сернойкислотой Реакция с триптофаномисерной кислотой То же . Пурпурнокоричневый Способ Лоури-Фолина (р.оиг у-Го 3 ф а) Подтверждаетпептиднуюсвязь Реакция с нингидриномпослегидролиэа с солянойкислотой Фиолетово"голубой Подтверждает,2 180 18,0 .68,9 30,5 21, 10 15,5 85,1 55,1 46,2 3 0 глутам Обр зец сравнения 0 4,9 2,3 38,1 йаО сравнения представляет сиспользованием того жедля образцов с 1 по 8, вдом экстрагирования горяавлении.Образец дляполученныйцета, что иобычным метнормальном П е 0,1 И - йаН 2 й - йанСО 3 Коричневый То же Коричневый То же р 3 50 р 7 46 р 8 24 рб р 2 57,4 51,9 29,8 ,5 84 3 50 3 42 4 бой о амого соотв ей вод зец,зидиомипри786855 10 Таблица 4 Сравнительные данные по противоопухолевой активности (Ъ) Полисахарид,полученный попредлагаемомуспособу Полисахарид,полученный поизвестномуспособу Доза,мг/кг 600100 100 100 100 75 10 85-95 85-90 19 формула изобретения Составитель С. Малютина Редактор П. Горькова Техред Н.Ковалева Корректор О. КовинскаяЗаказ 8872/63 Тираж 673 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП фПатент", г. Ужгород . Ул. Проектная, 4 1. Способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием, путем экстракции из грибов с последующей очисткой целевого продукта от балластных примесей, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения противоопухолевой активнос.ти полисахаридов, экстракции подвергают грибы Сог 1 о 1 ць Ь 1 Гогв 1 ь,Сог 1 оць сопсЬ 11 ег, Сог 1 о 1 цв сопьогв,Сог 1 оць Ь 1 гьцсць, Сог 1 о 1 ць рагдавепць, Сог 1 о 1 ць рцЬесепь или Сог 1 о 1 цьчегь 1 со 1 ог, экстракцию ведут водойили разбавленным раствором щелочипри автоклавировании под давлениемв течение 5-360 мин при 150-200 фС. 2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что экстрагирование5 ведут под давлением 5-20 кг/смй3. Способ по п.1; о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что экстракцию ведутразбавленным раствором щелочи в концентрации ниже 1 н,20 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Патент Японии 9 50-32304,кл. 30 А 32, опублик. 20.10.75.