“способ получения препарата “протолизин” из коммерческого препарата “протосубтилин”
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Номер патента: 2003688
Авторы: Рафаловская, Шишкова
Текст
2 ОО 3688 СОО С 1259 5 19) КУ51) 5 С 12 Е ИЗОБРЕТЕНИ Ь 3 Комитет Российской Федераци о патентам и товарным знака(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА "ПРОТОЛИЗИЙ" ИЗ КОММЕРЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА "ПРОТОСУБТИЛИН"(57) Использование; в офтальмологии для лечениявнутриглазных кровоизлияний различной этиологиии локализации и помутнений стекловидного тела, атакже в биохимической практике в качестве аналитического реагента, Сущность изобретения: способ.заключается в экстракции ферментов из коммерческого препарата "Протосубтипин", отделений балластных веществ, обессоливании ферментного раствора, ионообменной хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе, ультрафильтрации, осажденийпротеиназы ацетоном и лиофилизации, Разработаны оптимальные условия проведения процесса очистки, позволяющие на стадии ионообменнои хроматографии получить протеолитическую фрак - цию, свободную от примеси посторонних ферментов, с выходом по активности 49 - 50%. Конечный продукт "Протолизин" представляет собой белый или светло-бежевый амфорный порошок растворимый в воде и изотоническом растворе хлорида натрия. Протеолитическая активность протолизина при действии на казеинат натрия (температура 30 С) составляет 27 - 32 ед(мг белка. Зона наибольшей стабильности протеиназы рН 7,0 - 8,0, температура 5-10 С. Оптимальные условия действия: температура 50 С, рН 7,0 - 7,5. Ингибиторы - ионы тяжелых металлов, металлохелатные агенты Изоэлектрическая точка 8,3, мол.м. 30,5 - 34,о кДа. Препарат катализирует гидролиз пептидных связей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот, и не действует на пептидные связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот, активно расщепляет белки и пептиды, содержащие ароматические аминокислоты. 1 з.п, ф - лы.Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментной отрасли микробиологических производств, и можетбыть использовано при получении очищенных ферментных препаратов для медициныили для применения в качестве биохимических реактивов в научно-исследовательскойпоактике, Данное изобретение решает задачу получения препарата "Протолизин",представляющего собой высокоочищеннуюметаллопротеиназу, свободную от примесисппутс гвующих ферментов, Протолизин може г быть использован в офтальмологии длялечения внутриглазных кровоизлияний различной этиологии и локализации и помутнЕний стекловидного тела, а также вбиохимической практике в качестве аналигического реагента для изучения структурыбелков и пептидов,Приведенные способы получения высокоочищенной протеиназы многостадийны ихарактеризуются невысокими выходами конечного продукта,Предлагается способ получения высокоочищенного препарата металлопротеиназы (протолизина) из коммерческогопрепарата "Протосубтилин", содержащегометаллопротеиыазу. а-амилазу, Р,3 - 1,4 гл юканазу и другие бел ковые и римеси. Способ состоит е экстракции ферментативногокомплекса из протосубтилина, отделениибалластного осадка, гель-фильтрации ферментного раствора ионообменной хроматографии, концентрировании методомультрафильтрации протеолитической фракции, осаждении протеиназы ацетоном и лиофилизации,Для зкстракции ферментов из протосубтилина используют дистиллированную водуили 0,002 - 0,01 М буферный раствор рН 6,27,5, содержащие 0,1-0,5;ь СаС 12, необходимого для стабилизации металлопротеиназыи коагуляции балластных белков, Балластные вещества отделяют центрифугированием.Затем с целью подготовки ферментногораствора к хроматографии проводят егообессоли в ание методом гел ь-фил ьтрации.Для этого используют колонки с мелкопористыми сорбентами, имеющими крупные гранулы (например, сефадекс 6-25, молселект6-25. биогель Р).Гель-фильтрацию осуществляют в среде0,002-0,01 М буферного раствора при рН6.2 - 7,5, причем скорость протока ферментного раствора через колонку с гель-сорбентом должна быть в пределах 0,60 - 0,85мл/см мин, что позволяет получить белкогвую фракцию с наименьшим разбавлением,свободную от солей и пигмента, Ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе проводят в среде того же буфера, что и гель-фильтрацию. С целью максимальной очистки протеиназы 5 ат сопутствующих белков, пигментов и других примесей, а также повышения выхода целевого продукта в процессе хроматографии сорбцию фермента необходимо вести со скоростью протока 0,10-0,15 мл/см мин, 10 а элюцию протеиназы следует проводить0,18 - 0,22 М раствором МаС 1 в 0,002 - 0,01 М буфере со скоростью протока 0,15 - 0,35 мл/см мин. Проведение сорбции с меньшей2скоростью удлиняет процесс хроматогра фии и приводит к увеличению потерь фермента за счет инактивации, Увеличениескорости сорбции выше оптимальной величины снижает сорбционную емкость ионообменника по отношению к протеиназе. 20304050 Указанные пределы скорости элюции такжеоптимальны, так как обеспечивают минимальное разбавление протеолитическойфракции,Концентрирование элюата протеиназы осуществляется методом ультрафильтрации через полупроницаемые мембраны или полые волокна с размером пор, обеспечивающим задержание в концентрате белков с мол.м. выше 15 кДа (например, мембрана УПМ, волокно ВПУ-ПА). С целью снижения потерь фермента в процессе концентрирования и улучшения качества конечного продукта ультрафильтрацию необходимо проводить при рН 7,2 - 7,5, что соответствует зоне наибольшей стабильностипротеиназы, до величины протеолитической активности концентрата 8 - 11 ед/мл, Увеличение степени концентрирования приводит к инактивации фермента, а уменьшение степени концентрирования затрудняет процесс последующего осаждения протеиназы. В обоих случаях это приводит к снижению выхода целевого продукта, Для стабилизации протеиназы в процессе ультрафильтрации в концентрат при достижении величиныего активности 3,5-4,0 ед/мл можно ввести хлористый кальций из расчета 1,3 - 1,5 мг наединицу активности,Осаждение протеиназы.из концентрата проводится ацетоном при рН 8,2 - 8,4, т,е. вблизи изоэлектрической точки металлопротеиназы.Полученный осадок лиофилизируют, Протеолитическая активность и репарата "Протолизин" при действии на казеинат натрия (температура 30 С) составляет 2,7 - 3,2 ед/мг белка, Препарат не содержит примеси посторонних ферментов. Это белыйили светло-бежевый аморфный порошок, растворимый в воде и изотоническом рас 2003688творе хлорида натрия, Зона наибольшей стабильности металлопротеиназы: рН 7,0 - 8,0, температура 5 - 10 С, Оптимальные условия действия: температура 50 С, рН 7,0-7,5. И н гибиторы - ион ы тяжелых металлов, металлохелатные агенты, Изозлектрическая точка 8,3, мол.масса 30,5 - 34,0 кДа. Препарат катализирует гидролиз пептидных связей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот, и не действует на пептидные связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот, активно расщепляет белки и пептиды, содержащие ароматические аминокислоты,5 10 15 П р и м е р 1. Для получения препарата "Протолизин" 120 г коммерческого препарата "Протосубтилин" с протеолитической активностью 70 ед/г и содержанием белка 35 20 мг/г растворяли в 500 мл дистиллированной воды, добавляли к полученному раствору 0,66 г хлористого кальция. Величину рН ферментного раствора устанавливали равной 7,2, Общий объем полученной смеси дово дили до 600 мл. Нерастворившийся осадок отделяли центрифугированием, Ферментный раствор с протеолитической активностью 12,8 ед/мл направляли на гель-фильтрацию через сефадекс 6-25, Се фадекс, загруженный в колонку обьемом 5 л, уравновешивали 0,0025 М фосфатным буфером рН 7,2. На колонку наносили 598 мл ферментного раствора со скоростью 0,75 мл/см в 1 мин и после гель-фильтрации 35 получали обессоленную ферментную фракцию объемом 2000 мл с протеолитической активностью 3,0 ед/мл. Полученный ферментный раствор направляли на ионообменную хроматографию, которая 40 проводится на карбоксиметилцеллюлозе (КМ-целлюлозе), загруженной в колонку обьемом 1,2 л, Ионообменник уравновешивали 0,0025 М фосфатным буфером рН 7,2, Скорость нанесения обессоленного фер ментного раствора на КМ-целлюлозу равна 01, мл/см мин, Затем колонку промывали исходным буфером, содержащим 0,2 М Вас;Со скоростью 0,2 мл/см мин. При атом злюируется металлопротеиназа. Фракция 50 металлопротеиназы объемом 2500 мл имела активность 1,2 ед/мл, Концентрирование протеолитической фракции проводили методом ультрафильтрации через полисульфонамидную мембрану типа УПМпри рН 55 раствора 7,2, В результате получен концентрат объемом 180 мл с активностью 10,8 ед/мл. Далее протеиназу осаждали ацетоном при рН 8,2 и осадок лиофилизировали. Получено 0,52 г высокоочищенного препарата "протолизин" с активностью 2200 ед/г и содержанием белка 700 мг/г.П р и м е р 2. Способ получения препарата "Протолизин" из протосубтилина аналогичен способу, описанному в примере 1, до стадии гель-фильтрации. Для этого использовали колонку с биогелем Р, уравновешенным 0,01 М ацетатным буфером рН 6,2. На колонку наносили 598 мл фермент- ного раствора со скоростью 0,85 мл/см мин. После гель-фильтрации получа 2ли 1880 мл обессоленного раствора с протеолитической активностью 3;2 ед/мл, Этот раствор наносили на колонку с КМ-целлюлозой, уравновешенной 0,01 М ацетэтным буфером рН 6,2, Скорость протока составляет 0,12 мл/сммин. Элюцию протеиназы проводили исходным буфером, содержащим 0,22 М МаС со скоростью 0,35 мл/см мин.2 В результате получали протеолитическую фракцию объемом 2750 мл с активностью 1,1 ед/мл. Концентрирование злюата протеиназы проводили ультрафильтрацией через мембрану УПМпри рН раствора 7,5, Концентрат фермента объемом 207 мл и активностью 9,5 ед/мл напоавляли на осаждение ацетоном. Осаждение проводили при рН 8,3. Осадок лиофилизировали. Б результате получено 0,5 г высокоочищенного препарата с активностью 2100 ед/г и содеожанием белка 660 мг/г,П р и м е р 3. 350 г протосубтилина с протеолитической активностью 70 ед/г и содержанием белка 36 мг/г растворяли в 1500 мл 0,0025 М фосфатного буфера рН 7,5, К полученному раствору добавляли 8,7 г хлористого кальция, Общий объем полученного раствора довели до 1750 мл. Нерастворившиеся частицы удалили центрифугированием. Фугат объемом 1700 мл с активностью 13 ед/мл подвергали обессоливанию методом гель-фильтрации на молселекте 6-25, Для этого использовали 2 колонки объемом 5 л каждая. Обессоливание проводили в среде 0,0025 М фосфатного буфера рН 7,5. На каждую колонку с сорбентом наносили по 850 мл феументного раствора со скоростью 0,6 мл/см мин, Обессоленный раствор обьемом 5400 мл с активностью 3,3 ед/мл подавали на ионообменную хроматографию, Колонку объемом 4 л с КМ-целлюлозой уравновешивали 0,0025 М фосфатным буфером рН 7,5, На колонку наносили обессоленный ферментный раствор со скоростью 0,15 мл/см мин, Элюцию протеиназы проводи 2ли раствором 0,18 М ИаС в исходном буфере, пропуская его через колонку с КМ-целлюлозой с той же скоростью. Элюат объемом 8,8 л с активностью 1.0 ед/мл концентрировали методом ультрафильтрэции2003688 Формула изобретения Составитель Р,ВасиловТехред М.Моргентал Корректор Н,Ревская Редактор Л.Павлова Заказ 3309 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 через полое волокно марки ВПУ-ПА до объема 1,76 л, Протеолитическая активность концентрата составляла 3,5 ед/мл. В концентрат вносили 9,24 г СаС 2 и подвергали его дальнейшему концентрированию до содержания протеиназы в растворе 10,7 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТОЛИЗИН ИЗ КОММЕРЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПРОТОСУБТИЛИН, заключающийся в том, что проводят экстракцию ферментов дистиллированной водой или буферным раствором 0,002 -0,01 М при рН 6,2 -7,5 в присутствии 0,1-0,5 ф СаО 2, отделение балластных веществ, обессоливание ферме нтного раствора методом Гель-фильтрации в среде буферного раствора 0,002.- 0,01 М при рН 6,2 - 7,5 со скоростью протока 0,60 - 0,85 мл/см мин, ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе в том же буфере со скоед/мл, Объем концентрата составлял 550 мл, Далее протеиназу осаждали ацетоном при рН 8,4 и осадок лиофилизировали, Препарат "Протолиэин" имел активность 1920 ед/г 5 и содержание белка 670 мг/г. Из 350 г протосубтилина получено 1,7 г протолизина. ростью протока раствора при сорбции 0,10 10 - 0,15 мл/см мин, при элюции - 0,15 - 0,35гмл/см мин, используя в качестве элюента 0,18 - О;22 М раствор йаС, концентрирование методом ультрафильтрации через полупроницаемые мембраны или полые 15 волокна с диаметром пор, обеспечивающим задержание белков с мол,м. выше 15. кДа, до содержания протеиназы в концен.трате 8 - 11 ед/мл, осаждение ацетоном при рН 8,2 - 8,4 и лиофилизацию.20 2. Способ по п,1, заключающийся втом, что в концентрат по достижении величины его активности 3,5 - 4,0 ед/мл вводят .СаО 2 из расчета 1,3 - 1,5 кг на единицу протеол итичес кой активности.25
СмотретьЗаявка
05048498, 17.06.1992
Научно-производственное объединение "Биотехнология"
Рафаловская Татьяна Яковлевна, Шишкова Эмилия Александровна
МПК / Метки
Метки: коммерческого, препарата, протолизин, протосубтилин
Опубликовано: 30.11.1993
Код ссылки
<a href="https://patents.su/4-2003688-sposob-polucheniya-preparata-protolizin-iz-kommercheskogo-preparata-protosubtilin.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">“способ получения препарата “протолизин” из коммерческого препарата “протосубтилин”</a>