Способ получения модифицированных ферментов

ОП И Союз Советских Социалистических Республик(51)м 1,(л гС 07 С 7/02I А 61 К 37/48 Государстееницй комитет СССР по дедам изобретений и открытий(71) Заявитель Казанский ордена Трудового Красного Знаменигосударственный университет им. В,И. Ульянова-Ленина(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ 30 Изобретение относится к области биохимии, а именно к способу получения модифицированных ферментов и может использоваться для получения ферментов, модифицированных как растворимыми, так и нераствори)ыьи. солями диазония, в частности для получения ферментов, связанных с растворимыми носителями и иммобилизованных при помощи реакции азосочетания, Иммобилизованные Ферменты могут использоваться в качестве катализаторов в химической промышленности в реакторах проточного типа, а ферменты, связанные с растворимьви носителями помимо использования в качестве катализаторов в химической промышленности могут применяться как биологически активные вещества и лекарственные препараты.В литературе описаны способы модиФикации Ферментов путем кавалентного связывания их с растворимыми и нерастворимыми носителями (матрицами) .С этой целью особенно широко используют способы кавалентнога связывания ферментов с различными носителями при помощи реакций ацилирования (алкилиравания), при помощи изоцианатных (иэотиацианатных) групп, галоидциана, цианурхлорида и ега производных или реакции аэосочетания 1 Ц .Связывание фермента с носителем осуществляется, практически всегда, через аминогруппу диаминомонакарбанавых аминокислот. Исключение составля" ет метод аэосочетания, используя который можно осуществить связывание через акино-, сульфгидрильные-, циклические и гетерациклические группы аминокислот. Эта особенность реакции азосочетания дает воэможность осуществлять связывание ферментов через значительно большее количество точек, по сравнению са способами, в основе которых лежат узко специфические реакции на аминагруппы белков, Многоточечность связывания, как известно, положительно коррелирует са стабильностью связанных ферментов. Недостатком метода азосачетания является его, во многих случаях, низкая эффективность, определяемая количеством связан. нога с матрицей (носителем) ферментаИзвестен способ модификации ферментов, включающий получение солей диаэания из соединений, содержащихаминоакрильные группы путем ковалентного связывания их с нерастворимой солью диаэония на основе и-аминобензилцеллюлоэы (2.Обработкой азотистой кислотой (или раствором нитрита натрия н соляной кислоте) аминобенэилцеллюлоза превращается н сопь диазония, к которой добавляется растворенный в буФере фермент. После перемешинания и удаления иэ суспензии промыванием не модифицированного (не связавшегося с солью диазония) Фермента определяется выход конечного продукта. Выход модифицированной РНКазы и химотрипсина составляет 2,3 и 3,4 соответственно. Столь низкий выход обеспечивает упоминавшееся выше достоинство метода аэосочетания, позволяющее осуществлять многоточечное связывание фермента с носителем.Цель изобретения - разработка способа модификации ферментов ковалентным связыванием с растворимыми и нерастворимыми солями диаэония, позволяющего добиться большого выхода модифицированных ферментов.Это достигается тем, что н процессе модификации ферментов солями дг.,зония в реакционную смесь добавляют катализатор - акцептор протонов, обычно пиридин, триэтиламин, диэтиламин, или четвертичное аммониеное основание н конечной. концентрации 0,15-5.Процесс проводят следующим образом.Растворимые или нерастворимые соли диазония, например декстраны или соответственно целлюлозу, акти" вированные введением н них аминоарильных радикалов, обрабатынакт раствором БаИОв соляной кислоте при температуре 0-(+2 С). рН образовавшегося растнора полимерной соли диазония или суспензии, в слу чае нерастворимого носителя, доводят до 3-4. Ферменты растворяют н буфере и .добавляют к раствору акцептор протонов или четвертичноеаммониевое основание. Смесь ферментас катализатором добавляют при перемешиваниик соли диазония и оставляют на 10-14 ч. Конечная концентрация катализатора:в реакционной смеси 0,15-5. Ковалентно связанныеФерменты в необходимых случаях отделяют от несвязавшихся Ферментов иакцептора протонов любым доступнымМетодом (растворимые коналентносвязанные ферменты, например, припомощи гель-фильтрации или ионного обмена и т.д.; нерастворимые -центрифугированием, фильтрованиеми др)Получение модифицированного фермента в присутствии катализаторав 5-10 раз увеличивает выход связанного фермента по белку и н 4 - 7 раэ поактивности, Это, несомненно, увели -чинает экономическую эффективностьсвязывания ферментов с носителямипри Помощи азосочетания. Увеличениевыхода связанных ферментов предлагаемым способом позволяет широко использовать его вместо методов коналентного связывания, оснонанных наузкоспецифических реакциях. При этомс большим выходом вс 1 зможно получениеФерментов, связанных с носителем наи -большим количеством точек связывания, т.е. наиболее стабильных и, следовательно, экономически наиболеевыгодных,П р и м е р 1. Получение рибонуклеазы, ковалентно связанной срастворимой солью диазония (с растворимым м-аминобензилоксиметилдекстраном).2 О 11 г м-аминобенэилоксиметилдекстрана растворяют в 100 мл 0,5 НС 6охлаждают до 0-2 С и добавляют400 мг ИаИО Диазотируют 5 мин,подщелачивают 3,5 н. ИаОН до рН 4,0,Г 5 и к диазотированному полисахаридудобавляют 1 г панкреатической рибонуклеазы, растворенной в 75 мл0,4 М буфера трис-НС 0 рН 8,5, содержащего 0,33 пиридина. Смесь оставляют на 14-16 ч, Несвязанный ферменти пиридин отделяют от продукта реак, ции при помощи гель-фильтрации насефацексе С - 75 н системе 0,2 М ИаЮ.Выход связанной рибонуклеазы побелк,: 9 8; по активности 30.П р и м е р 2. Получение рибонуклеазы, ковалентно связанной снерастворимой солью диаэония (см-аминобенэилоксиметилцеллюлозой) .К 0,1 г м-аминобенэилоксиметилцеллюлозы в 4 мл 0,5 н, НС 8 припостоянном перемешинании, добавлялиО р 00 4 г БИО (О 2 С), Диаэотируют5 мин, подщелачивают 3,5 н. ИаОНдо рБ 4,0 и к диазотированной целюлоэе добавляли 0,1 г панкреати-:еской рибонуклеазы, раствореннойн 10 мл 0,2 М боратного буфера рН8,5 содержащего 0,26 пиридина,Смесь перемешивают в течение 14 - 16 чи затем несвязанный Фермент и пиридин отмывают на фильтре 0,14 М ИаСВВыход модифицированной (иммобилизованной) рибонуклеазы по белку50;по активности 22.55 При проведении связывания рибонуклеазы в аналогичных условиях, нов отсутствии катализаторов, получаютследующие результаты.При связывании рибонуклеазы с6 О растноримым м-аминобензилоксиметилдекстраном выход модиФицированногофермента по белку 20 (по активности 8-10).При связывании рибонуклеазы с65 м-аминобензилоксиметилцеллюяоэой,5 105 10,0 ани р и Выход модифицированной рибонуклеазы вотсутствии пирдина принят эа100. 5 5 О 5 60 выход модифицированного фермента побелку 5, по активности 3.П р и м е р 3. Получение связанной рибонуклеазы в присутствии диэтиламина.Условия связывания и соотношениереактивов те же, что в примере 1,Д качестве катализатора используютдиэтиламин конечной концентрации0,2, рН реакционной смеси 8,5.Выход связанной рибонуклеазы по 1белку 60, по активности 25,П р и м е р 4. Получение связанной рибонуклеазы в присутствии триэтиламина.Условия связывания и соотношениереактивов те же, что в примере 1.В качестве катализатора используюттриэтиламин конечной концентрации0,2. рН реакционной смеси 8,5,Выход связанной рибонуклеазы побелку 90, по активности 28.П р и м е р 5. Получение связанной рибонуклеазы в присутствии четвертичного аммониевого основания,Условия связывания и соотношениереактивов те же, что в примере 1. 2В качестве катализатора используютчетвертичное аммониевое основаниеконечной концентрации 0,2, рНреакционной смеси 8,5.Выход связанной рибонуклеазы 3по белку 65, по активности 24. П р и м е р 6. Определение верхнего и нижнего пределов концентраций пиридина, каталиэирующего модификацию рибонуклеазы реакцией азосочетания.Определение проводят сравнением выхода модифицированного продукта вреакции модификации фермента диаэотированным м-аминобензиловым спиртом в зависимости от концентрации катализатора.3 мг м-аминобензилового спиртарастворяют в 0,5 мл О,5 н. НСР, диазотировали на холоду в течение 5 миндобавлением эквивалентного количества НаБО. Затем смесь подщелачиваютдо рН 4 3,5 н. раствором ВаОН и приливают к 5 мг рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,2 М трис-НСВ -буферарН 8,5 с пиридином различной концентрации или без него (в контроле).Через определенные промежутки времени 10, 20 и 30 мин из реакционнойсмеси отбирают аликвоты по 0,2 мли приливают к 5 мл 0,2 раствораазида Иа в 0,5 н. ИаОН.Выход модифицированного ферментаопределяют по разнице оптическойплотности образцов при 350 нм модифицированных с катализатором и вего отсутствии,В табл.1 дана зависимость выходамодифицированной рибонуклеазы от концентрации пиридина,Таким образом, нижний и верхний пределы концентрации пиридина, катализирующие реакцию азосочетания равняются .соответственно 0,15-5,0.П р и и е р 7. Влияние пиридина на модификацию различных ферментов реакцией азосочетания.Панкреатическую рибонуклеазу, трипсин и химотрипсин подвергали модификации диазотированным м-аминобенэи.-, ловым спиртом в присутствии катализатора и без него.а), 3 мг м-аминобензилового спирта растворяют в 0,5 мл 0,5 н. НСО диазотируют на холоду в течение 5 мин добавлением эквивалентного количеотва БаИО Затем смесь подщелачивают до рН 4 3,5 н. раствором МаОН и приливают к 5 мг панкреатической рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,2 М трио-НСЮ-буфера рН 8,5 с пиридином и без него. Конечная концентрация пиридина 1. Через 20 мин из реакционной смеси отбирают аликвоты по 0,2 мл и приливают к 5 мл 0,2 раствора аэида натрия в 0,5 Б МаОН. Выход модифицированного фермента определяют по разнице оптической плотности образцов при 350 нм, модифицированных с катализатором и беэ него.б). Условия проведения, количеств и соотношение реактивов в реакции модификации аналогичны описанным в пункте а) для панкреатической рибонуклеазы за исключением того, что в качестве аэосоставляющей испольэова ли трипсин,671284 Формула изобретения Таблица 2 Выход модифицированноге с катализатором фермента,Ъ20 мин Фермент 1. Панкреатическая рибонук- леаза 122 1 2. Трипсин.118 120 3. Химотри псин Составитель Ь. БочаровТехоец М.Келемеш Корректор Е, ПаппЗаказ 8271/49 Тираж 513 ПодписноеЦИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1130 35 москва, жРаушская наб. д, 45Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,4 Редактор Л. Письман в). Условия проведения, количест. во и соотношение реактивов в реакции модификации аналогичны описанным в пункте а) для панкреатической рибонуклеазы, за исключением того, что в качестве азосоставляющей ис" пользовали химотрипсин.В табл.2 отражено влияние пири- дина на модификацию различных ферментов диазотированным м-аминобензиловым спиртом. П р и м е ч а н и е. Выход модифицированных безкатализатораферментов принят за 100. 1, Способ получения модифицированных ферментов, включающий получениесолей диазония из соединений, содержащих аминоарильные группы, их обработку раствором нитрита натрия вкислой среде и взаимодействие полученных сслей диазония с ферментами,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью увеличения выхода продукта,"О взаимодействие фермента с солью диазония осуществляют в присутствиикатализатора - акцептора протоновили четвертичного аммониевого основания в конечной концентрации15 О, 15 - 5,2. Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве катализатора акцептора протонов используют пиридин, диэтиламин илитриэтиламин.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Иммобилизованные ферменты.Современное состояние и перспектива25 т.т, 1, 2, под ред, Березина И,ВАнтонова В.КМартинека К. Изд-воМосковского .университета, 1966.2. М 1 Ся А., Яипкпах 1 а 1,.3., БупЪез 1 з оЕ Ь 1 о 1 од 1 са 11 у ас 11 че се 11 п 1 озейег 1 а 11 чез Иацге 189, 576, 1961