Способ получения полипептидного антибиотического комплекса, обладающего противогрибковой активностью

ц 632307 Союз СоветскихСоцналксткческихРеспублик ОП ИСАЙИ ЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ЙА 7 ЕНУУ(43) Опублнков Фосударстеавний ввитет 66 ввта Маестрав СССР а двая имбреваФ в вткрытий(45) Дата опубликования описания 15.09.78 Иностранная фирма"Эли лилля энд Компани (США)(54)-СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДНОГО АНТИБИОТИЧЕСКО 1 О КОМПЛЕКСА, ОБЛАДАЮШЕ 1 О ПРОТИВОГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ пос а и Изобретение относится к микробиологической промьппленностй, в именно к производству антибиотиков.Предлагаемый способ получения полинептидного антибиотического комплекса,обладающего противогрибковой вктивностио, состоит в том, что штамм ЬЗагф 2 Ьяв ю 306 ттб МЧИМ ВИ 2 выращиввют в аэробных условиях на питательной ср .де, содержащей источники углерода, взота и мине- Оральные соли, а ледуюшим выделениемцелевого продукт. разделением его накомпоненты.Штамм Мрет Язйоб пЫцИсщс; КЯВ. 8112храниасяв коллекции культур исследовательской лаборатории северных районов Министерстваа сельского хозяйства США, службасельскохозяйственных исследований,Пеория, Иллинойс, 61604 под номеромКЛЯТ 8112 и характеризуется следую)шими свойствами.оСреда Чапека. При выращивании нри25 С в течение двух недель культурадостигает в диаметре 4 см. Колонияявляешься мелкоскладчатой и имеет силь- зб но городчатый край, состоящий из корич неввто-желтых нитей. Иногда имеется бесцветный эксудвт, становящийся,со временем розоватым. Нвд поверхностью находятся свободно переплетенные, почти сферические пучки мицелия. По мере созревания этих пучков они все более плотно сплетаются и переплетаются. В начале роста цвет изменяется от белого до цвета буйволовой кожи, стайовясь туск-, лым желто-зеленым. В возрасте двухнедель всходы становятся тусклыми оранжево-желтыми. После трех недель широко рассеянные конидивльные головки, с цветом от белого до слегка желтэго, становятся темными серовато-желтымн. Какого-либо растворимого пигмента не выделяется.Конндиальные головки вначале распространены в пространстве, но с воэрас.том становятся короткими и цилиндрическими, Молодые сферические головки могут иметь в диаметре вплоть до 700, но средний диаметр составляет 60.ц. Длина цилиндрических головок составляет от75 до 125 р, а ширина от 30 до 65 р,при среднем размере 951 г х 47% .Конидиоспорь 1, пузырьки и фиалидыгладкостенные и сг 1 або-коричиевые, Длинаконидиоспор изменяется эт 38 й и до 56.К.но может достигать 85 ф, Их ширинесоставляет вплоть до 5 1 г,Пузырьки изменяются от неполностьюсферических до полусферических и наконцах могут выравниваться. Диаметрпузырьков Обычно составляет от 8 и до10 ц, а в среднем 9, 6 цСтеригма типа бисера, а вторичнялстеригма часто парная, Форма первичнойстеригмы близка к клинообразной. Их длина изменяетя от 3,2 ц до 6,30 составляя В среднем 4,40, Б самом широкомместе они имегот 2,8 йг; Вторичная стеригмй им 8 ет форму удлиненной бутыггки,В сВОем самом шиООком мест 8 они достигагот 34 гц, сужаясь к одному ко 1 Н 1 удо ширины 1 Я . Их длина измеплстсяОт 4,711 до 7,9 пгг составг 1 яя в среднем6,2 11Конндии мепкоскпядчятые, сферические, с цве"1 ом от желтого до зеленого иизменяютсл в диаметре от 1,6 до 4,6 рсоставляя в среднем 2,5 гцКлейстотеций сферич 8 ский, тонкост 8 нный Б изменлет цВет От прозрачноГО в начальный пернод до темно-пурпурного в период окончйтельио 1 О развя гила Е 1 О диам 8 тр измеаяется От 185 Я до 3201, составлччВ среднем 200 И,Лски прозрачные, от сферическихЙО Овальных и МОГут измег 1 ьчяться передрйэвнтием клейстотецил. СферическиеЙскн имеют диаметр 12,6 1 г . Средний)Йэмер ОВальных аскОВ рЯВен 14,1 цк 11,1 ф3и изменя 8 тсл от 12,6 г до 17,411 подлнье и От 9,5 Ц до 12,63 по шир 11 не.Аскоспоры Гпадкостенные, оранжевыеБ украгпеиы двумя параллельными акватошрийльными гребешками котООы 8 не разрушяются и имеют ширину 0,8 ц, Еслигребешок вкваториаг 1 ьный, то он проходитчерез длинную ось линзообрязной аскосЦоры, дпинй КОторой составпл 8 т От 4,3,6ДО 5 р 1 Ц р а дирнна - От 2,7 П до35 гв среднем размер ее равен 4,51323. Если Гребешки периферийны 8, тоЙскоспОря кажется сферическойр а телоимеетднйметр равный длнне линзООбразНОГО ВИДЙеЛгйр с солодовым акстрактом. ПрнОВырйЗпиван 1 п 1 при а.,5 С культура растетбыстро достиГЙя диам 8 тра 5 см эа десять дией и ВппОть до 7 см за Время от трех до четырех недель, Колонии бархатистые, желто-зеленого цвета, На седьмой день над поверхностью и в нижнемпоясе появляются беспорядочные небольшиебелые пучки кпе-ок, Зги пучки клеток с в озрастом становятся тускло-желтыми. Городчятяя периферия колонии состоит из желтовато-коричневых нитей Обычно поверхность имеет умеренный оливково-зеленый цвет.Конилиальное и яскогенное состоянияс небольшими исключениями аналогичныпри росте на агаре Чапека. Пузырькиболее мелкие с диаметром, изменяющимся от 6,30 до 11,0 рг в среднем 8,7 рСферические аски имеют диаметр 11,00ширину от 9,51 г до 10,3 ггг, Средний размераскоспор 4,0 р х 3,25,указанный дгтамь,г можно выращиватьна питатепьнььх средах содержащих источники углерода, напоимер сахарозуггпокозу, мапьтозу, глицероп, источникиазотанапример анзиматический гидропизат казеи 11 Я, мука хлопковых ссмян,жидкость от вымачивания зерна, минеральные сопи н микрозпементы.Выпоггнение предлож 8 ннОГО способанллюстрируетсл спедуюдгим примером.П р и м е р, Дпл получения посевногО мятериаля штямпп Д 5 РВГЯ 1 И 16П 1301 ОП 5 НОР, 8112 инхубируют на Среде следующего состава (в %): томатнаянаста - 2, детская Овсянка - 2, агар,деионизированная вода - 94 при 25 С втечении 7 дней, и смывают споровьгй материал говяжьей сывоооткойПопу 18 нной суспензией засевагот50 мл вегетативной среды следующегосостава (В оо) : ггпокоза - 1,0, глицероп - 1,0, мука хлопкового семени - 2,5,угпекисггый кальций - 0,1, вода - 95,4и инкубируют в колбе Эрг 1 енмейера на,Ипя 11 олучения большого количества посевного материала 10 мл вышеописанной инкубированной вегетативной среды испопьзугот для засева 200 мг 1 вегетативной растительной среды второй стадии, имеющей тот же состав, что и состав вегетативной среды. Среду второй стадии инкубпруют в 2-литровой дп 1 рокогорлой колбе Зрпенмейера при 25 С в течениеО/48 часов на встрлхиьателе,250 об,гмин),Иикубированнуго Вегетативнуго среду Второйг ступени (800 мг 1), приготовленнй как ОписанО вьпде используют для/ среды следующего состава (в %):Сахароза 2,0Мальтоза 1,0Солодовый экстракт 1,0Патока 0,5Жидкость от вымечивания зерна 0,5Энзиматический гидролиэат каэеина 0,5Вода 94,5После стерилизации в автоклаве прн 120 С в течение ЗО минут под давлеонием РН среды составляет 7,1. Засеянную ферментационную среду подвергают ферментированию в 165-литровом фермено тере в течение 5 дней при 25 С. ферментационную среду аэрируют стерильным воздухом со скоростью 40 об/мин и пере-мешивают обычными мешалками со скоростью 250 об/мин./После ферментации культуральную жидкость (200. л) отфильтровывают через6 фильтр из диатомовой земли, Отделенный мицелий экстрагируют метанолом (100 л).Метанольный экстракт концентрируют под вак"мом до объема примерно 50 л. Концентрированный метанольный экстракт подкисляют до РН 3,5-4,0 добавкой соляной ф кислоты. Полученный раствор дважды экстрагируют 0,5 объемами хлороформа. Хлороформовые экстракты объединяют и концентрируют до объема примерно 1 л.Часть этого хлороформного концентората (250 мл) добавля 1.т к ацетонитрилу (100 мл). Полученный раствор профильтровывают, а фильтрат концентрируют под вакуумом до объема примерно 150 мл. Концентрированный экстракт помешают в силикагелевую колонку (55 Х 54 см). Колонку элюируют смесью ацетонитрил: вода (97:3) со скоростью 5 м,1/мин, собйрая фракции объемом около 10 мл. Элюирование контролируют силикагелевой тонкослойной хроматографией с использованием системы растворителей бензол: метанол (7:3). Наличие антибиотического комплекса контролируют биоавтографией с использованием Сап 33 а а 6 ЬЕОЪ .:фрак-а ции 136-190 содержат антибиотическую смесь. Эти фракции объединяют и выпаривают под вакуумом с получением 453 мг антибиотического комплекса.Выделение антибиотика Апроизводят следующим образом. Часть антибиотической смеси, содержашей антибио тик Аи другие второстепенные факторы (200 мг) и полученной как опи-,сано выше, подвергают хроматографическому разделению на силикагелевой колонке (1,5 х 6,0 см), Колонку элюируютсмесью ацетонитрил; вода (95:5) соскоростью 1 мл/мин, собирая 5 мл фракции. Фракции контролируют как описановыше. Фракции 1-3, содержавшие антибиотик А, объединяют и конц нтрируют под вакуумом до масла. Это масло вновь подвергают хроматографическому разделению на силикагелевой. колонке(1,5 х 12 см), элюируют смесью ацетонитрил: вода (97:3). Фракции 15.+201 содержавшие антибиотик А, объединяюти концентрируют под вакуумом до масла.Это масло растворяют в 2 мл раствораметанола в диэтиловом эфире. Образовавшийся осадок отделяют фильтрацией и высушивают с получением 35 мг антибиотика А,Антибиотик А, обладающий противогрибковой активностью, имеет:Эмпирическую формулу СНЫ) Ав20Элементарный состав, %:С 56,24Я 7;54м 8,84О 27,39молекулярный вес 1100а, =-44 (С О СН ОН)Ж = -156 (С 0,5 СН ОН).Максймальные частоты поглощения вультрафиолетовом спектре (в кислом инейтральном метаноле): 225, 275, 284.В основном метаноле - 245 и 290 нм.Максимальные частоты поглощения винфракрасном спектре ( КЗ" ):2,97 (сильный), 3,30. (слабый),3,36 (выступ) 3,39 (средний),3,47 (слабый), 5,97 (сильный)6,0 б ( сильный), 6,45 ( средний )6,53 (средний), 6,83 (средний),7,78 (слабый) 8,00 (слабый)9,07 (слабый), 11,65 (слабый). Спектр ядерно-магнитного резонанса176 1 174 З 1734 1727172 4169,8; 158,4; 132,8; 130,9; 129,6;129,0; 1162 770 757 744 713709 696 683 624; 58 7 56 956,1; 52,9; 39,0; 38,5; 36,9; 35,2;282 270 265 236 201; 196,14,4 и 11,3,Ч 1 = 0,35 при тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованиемсистемы раствооителей бензол ;метанол632307 Сапддо а 1 Ьсопа 0,62 5 ТРсйарИ 1 оп п 1 епЬъф"арИ 1 еь 0,078 Сапо3 а Ь"ареа бв 3,12 Составитель Н. БондаренкоРедактор О. Иванова Техред А, Алатырев Корректор Е, йичинская Заказ 6219/2 Тираж 526 Подписное11 НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Рвушская набд, 4/5 филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4(7."3) и биоввтографииСдп 3 с)д а 6 Ь 1 сдп 5 для контроля.Антибиотик А- белое аморфное вещество, растворимое в метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, этилвцетате и в водных растворах с рН выше 7,0; не растворимо в диэтиловом и тетралейном эфирах.Антибиотик Аобладает противо грибковой активностью, Эту активность Противогрибковая активность антибиотика Адополнительно показана опытами п ч(ко, При введении двух доз: антибиотика мышам, зараженным Сдпд ело дЬсопв,была обеспечена зашита против С,сзИ)сапа. Мерой защитного действия является величина ЕО 5 (эффективнвя доза в мг/кг, защищающая 50% мьпцей). ВеличиныП) 50 для антибиотика против СОИд да ОСЬ со на мышах составляли ЗО 30 мк/кг ( интраперитонвльное введение) и 50 мг/кг (подкожное введение),При введении антибиотика А интраперитонвльно или подкожно мышам 35в количестве 100 мг/кг дважды в деньв течение трех дней (общее количество600 мг/кг) не было обнаружено призна.ков острой токсичности. измеряют с помощью обычной диск-диффузионной методики. ( 6-миллиметровыетампоны погружают в растворы, содержащие антибиотик, помешают на агаровыепластины, засеянные испытуемым организмом), В таблице приведена минимальная ингибирующая концентрация (МИК)на диск, при которой антибиотикАингибирует перечисленные оргвнизмы. Также не было признаков острой т:оксичности при введении антибиотика Аинтраперитонально мышам в количестве 200 мг/кг трижды в течение 24 часов (всего 600 мг/кг). Формула изобретения Способ получения полинептидного антибиотического комплекса, обладающего противогрибковой активностью, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что штвмм 1 врерфИОв и МО 1 ппь КЦЯ 1, 8112 выращивают в аэробных условиях н" питательной средесодержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением целевого продукта и.разделением его нв компоненты.