Способ получения литических ферментов

СОЮЗ СоветскихСоциалистическихРеспублнн ЕТЕЛЬСТВУ АВТОРСКОМУ СВЙ тва Ъ"е авт. свидетель ависимо л С 21 л 13,10 7,28-13),Х,1971 ( 1707 явлен ением заявкис присоед Государственный комитетСовета Министров СССРоо делам изаеретенийи открытий рите ДК 577,15.07(088,8).)ллетснь4 1 и кое а но 10.Х 11.1973. Опу я 1,%.10 Да оп бликования описан Авторыизобретенипина, Л. М. Серегинаоваогни АН СССР явител обиологии, ических ферпродуцентов ей источники минеральных м ферментов ерментов микроорг зуют микр пользуют11-4.азота длязную муых дрож оптопозроержимогоба рубцода) чц 1 дапз птированя одиноч- Споронолые очер- очка спор Изобретение относится к мнкрИзвестен способ получения литментов путем выращивания ихна питательной среде, содержащуглерода и азота в присутствиисолей с последующим выделениеиз культуральной жидкости.Для повышения активностикачестве продуцента используютнизмы рода М 1 сгогпопозрога.Из рода М 1 сготпопозрога исполорганизм вида ц 1 дагЬ. В качестве продуцента из вида иштамм М 1 сгогпопозрога чц 1 рапз РАВ качестве источника углерода иданного штамма используют кукуру ку с добавлением к ней сухих кормовжей,Термофильный актиномицет М 1 сгга чцдапз РА-4 выделен из сод рубца крупного рогатого скота (про вой жидкости привезена из АшхабаХарактеристика М 1 сгогпопозрогаРА-4. Морфология, Мицелий песе ный, тонкий, На гифах формируютс ные споры диаметром 0,5 - 0,7 мк.шение обильное. Споры имеют округ тания и полигональную форму, Обол гладкая. 5 10 15 20 25 30ИЧЕСК 14 Х ФЕРМЕНТОВ Культуральные признаки. Рост на органических средах. Крахмально-казеиновая среда, Прп 27 С роста нет. При 35 С и 65 С рост очень слабый. Рост хороший при 50 - 60 С.Шестисуточные колонии при 55 С с диаметром 5,0 - 8,5 см плоские, с мелкимп радиальными складками, светло-бурые, центр колонии несколько приподнят, Нижняя сторона колоний окрашена в желтовато-бурый или охряно-бурый цвет. Пигмент в среду не выделяется. Воздушный мицелий белый, мучнистый или тонковолокнистый.Сусло-агар - нет роста. Ломтики картофеля - нет роста, но на 20%-ном картофельном отваре рост культуры хороший. МПА - рост хороший, Колонии кожистые, плоские, вросшие в агар. Нижняя сторона колоний буроватая. Среда не пигмептирована. Воздушный мицелпй белый, мучнистый.Рост на синтетических средах СР 1, СР 111, среда ь 1 апека - Докса - слабый. На специально подобранной среде с глюкозой рост хороший. Колонии бесцветные нли буроватые. Нижняя сторона колонии желтовато-бурая. Воздушньш мицелпй белый. Среда не пцгмептирована.Физиолого-биохимические свойства. Желатину разжижает. Крахмал гидролизует. Молоко коагулирует, пептонизирует. 1-1 итраты не восстанавливает. Клетчатку не разлагает,407945 100 ОД реакционной смеси без фермента через время т Из источников углерода хорошо усваивает глюкозу, крахмал, декстрин, глицерин, мальтозу, маннит и фруктозу, Хуже усваивает лимоннокислый и яблочнокислый натрий, Нет роста на средах с арабинозой, галактозой, ксилозой, лактозой, рамнозой, сахарозой, маннозой, инулипом, инозитом, дульцитом, натриевыми солями уксусной, щавелевой, янтарной и пировиноградной кислот.Из минеральных источников азота усваивает КИОз в сочетании с (МН 4) 250 но каждую из этих солей в качестве единственного источника азота плохо использует,Из органических источников азота лучше всего усваивает пептон, хуже аспарагнн, глпцин, мочевину. Не усваивает алании как единственный источник азота.Культура обладает очень слабой антибиотической активностью,В лабораторных условиях культивирование Мзгогпопозрога чц 1 дагз РА-4 проводят глубинным способом (на качалке с 200 - 250 об/мин) в колбах Зрленмейера емкостью 250 мл с 50 мл питательной среды. Состав среды следующий, г/л: Кукурузная мука 20 Кормовые дрожжи (сухие) 5 (ХН 4) я 804 1 СаСОз 1 В среде водопроводной воды находится до 1 л; рН среды после стерилизации 7,0 - 7,2. Температура культивирования 45 - 50 С, Длительность культивирования 48 час. Реакционная смесь без фермента ОД через время гСпектр действия препарата литических ферментов Мгсгогпопозрога чцагапэ РА-4 представлен в таблице.Клетки грамположительных и грамотрицательных бактерий растворяются как мертвые, так и живые, причем последние характеризуются наибольшей степенью чувствительности, Из испытанных 12 видов грамотрицательных бактерий легче всего лизировались клетки Е. со, Ргоецз чцагапэ, Рзецсогпопаз Ь 1 цогезепз, АегоЬасег с 1 оасеа.Суспензии мертвых клеток указанных бактерий при инкубации с ферментным препаратом в конечной концентрации 0,01% просветлялись на 100% за 10 мин, а суспензии живых клеток - за 30 мин при концентрации более высокой - 0,025%. )Кивые клетки других грамотрицательных бактерий: АегоЬасег аегодепез, ч 1 Ьпо совсоцз некоторых видов рода Нуг 1 годепогпопаз лизировались на 60 - 90% при инкубации в течение 1 - 2 час или более при 0,025% концентрации ферментного препарата. 5 10 15 20 25 30 35 45 50 55 60 65 4В качестве посевного материала используют споровую суспензию Мгсгогпопозрога чц 1 дагз РА-4, выращенного на агаризованной среде указанного выше состава.Характеристика спиртового препарата литическак ферлгентов Мгсготопозрогаои/дапв РА-4,Литические ферменты в виде технического препарата получают путем выделения их (при охлаждении) из центрифугата культуральной жидкости осаждением этиловым спиртом в соотношении 1: 4 (по объему). Выход препарата составляет в среднем 3 г/л. О качестве ферментного препарата судим по литической активности, определяемой по изменению оптической плотности суспензии испытуемых микроорганизмов и но протеолитической активности, определяемой по методу Номото и Нарахаши в модификации Каверзневой и Рассулина,При определении литической активности 4,5 мл суспепзни мертвых или живых клеток испытуемых микроорганизмов (с начальным ОД 0,5 - 1,0, что соответствует 8 - 16 мг по сухому весу) в 0,025-метровом фосфатном буфере с рН 8,0 с 0,5 мл 0,1% или 0,25%-ного раствора ферментного препарата в том же буфере инкубировали при 60 С. Гидролиз проводили в пробирках, помещенных в ультратермостат, Оптическую плотность измеряли в пробирках на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 мм, В качестве контроля на автолиз брали ту же суспензию клеток испытуемых микроорганизмов и буфер вместо фермента, Коэффициент уменьшения мутности рассчитывается по формуле (в %): реакционной смеси с ферментом через время г По отношению к клеткам грамположительных бактерий действие препарата литических ферментов М 1 сгогпопозрога чц 1 дапз РА-4 было менее эффек 1 ивным: за 30 мин - 1 час степень их лизиса составляла 20 - 40% и не увеличивалась при более продолжительном времени инкуба ции.Еще большая устойчивость к лизису наблюдалась у организмов рода МусоЬас 1 епцгп, ВгечЬас 1 епцпг и СогупеЬас 1 епцгп, Исключение составляла культура Мусососсцз 1 ас 1 з, выраженная на среде с н-парафинами, лиофильно-высушенные клетки которой лизировались на 94% при пятнадцатиминутной инкубации с ферментным препаратом в концентрации 0,01%, а живые клетки - на 50% через 1 час.Из дрожжей были испытаны Сапг 1 гса 1 гор 1. саз и С. дц 1 еппопг 11, выращенные в средах с углеводородами, Степень лизиса мертвых клеток дрожжей составляла 50 - 60% при инкубации с ферментным препаратом в течение 1 час, а живых - 3 час,407045 Ковффициентуменьшенияоптическойплотности Конечная концентрация ферментного препарата,%Время инкубации, Испытуемый организм мин Ба к те ри и г р амотр и ца тельныеЕвсйегсЬа со 125мертвые клеткиживые клетки 0,0020,01 15 15 100 98 Ргосецвцайагв 127 мертвые клетки живые клетки 0,010,025 10 30 100 95 Рвецйотопав 1 цогевсепв 540 мертвые клетки живые клетки 10 30 0,010,025 100 100 АегоЬасег соасеа А - 30 живые клетки 0,01 100 15 АегоЬасег аегопепев 906 мертвые клетки живые клетки 96,5 72,5 0,01 0,025 10 120Яеггаа шагсевсепв живые клетки 0,01 56,0 15 ЧЬгосовсоцв живые клетки 62,9 0,025 60 АсаИяепев вр, живые клетки 52,0 0,01 НЫгодепогпопав гцПапаИ живые клетки 0,025 94,6 60 Нсгояепогпопав вр, 17549 АТССживые клеткимертвые клеткиНЫгопепоаопав ецгорЬаживые клетки 0,025 0,025 65,2 22,4 240 240 41,4 120 0,1 Нбгопепотопав вр. 17716 АТСС живые клетки 0,025 100 120 Ба ктери и г рам положи тельныеМсгососсцв увойейИсцв 109мертвые клеткиживые клетки 50,840,6 0,010,025 30 120 Мкгососсцв ЙепИШсапв живые клетки 0,025 50,0 240 Загспа цеа 486мертвые клетки51 арЬуососсцв ацгецвмертвые клеткиВасИцв гпепаегцш 512мертвые клеткиВас. вцЬИв 428мертвые клеткиВас. сегецв 370мертвые клеткиВас. ЬгетЬ 224(термофильный штамм)живые клетки 44,0 0,01 60 20,3 0,01 30 28,8 0,01 30 0,01 18,9 30 20,0 0,01 60 0,025 40,0 АгйгоЬасег сИгецв 654 мертвые клетки живые клетки 0,025 0,025 74,1 545 120 120 Другие микроорганизмыМусососсцв асв 41мертвые клеткиживые клетки 94,0 50,0 0,01 0,01 15 60 Спектр действия литических ферментов термофильного актиномицета Мсгогпоговрога Чцайагв РА-4Коэффициент уменьшения оптической плотности Время инкубации, Испытусмьш организм мин 0,01 44,4 0,01 60 16,5 0,01 6,3 60 0,01 12,7 60 0,01 60 7,5 0,010,025 50,9 65,6 601 с".0 Сап 1 Ыа дц 1 йег 1 попс 311 НП ы.рзйо,с клсти живые клетки 0,010,025 61,6 66,6 60180 Азрет 8 Шцз 1 еггсцз 17 Р (термофильиый штамм) живые клетки 0,025 180 36,2 Предмет изобретения Составитель Г. Субботина Редактор 3. Твердохлебова Техред 3. Тараненко Корректор Л, НовожиловаЗаказ 1050/8 Изд.329 ЦНИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и Москва, )К, РаушскаяТираж 647 ПодписноеСовета Министров СССРоткрытийнаб., д. 4/5 Типография, пр. Сапунова, 2 Мусососсц. 1 ц 1 ецз 650 мертвые клетки МусоЬас 1 ег 1 цш а 1 Ьцгп 88 мертвые клетки МусоЬас:,ет 1 цш РЫс 1 648 мертвые клетки СогупеЬас 1 ет 1 цт ш 1 сЫдапепзе мертвые клетки Вгст 1 Ьас 1 ет 1 цп ашшоп 1 адепез 677 мертвые клетки СапйИа 1 тор 1 са 11 з Т - 20 мертвые клетки живые клетки1. Способ получения литических ферментов путем выращивания их продуцентов на питательнои среде, содержащей источники углерода и азота в присутствии минеральных солей с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения активности ферментов, в качестве продуцента используют микроорганизмы рода М 1 сгогпопозрога. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что изрода М 1 сгогпопозрога используют микроорганизм вида чц 1 даг 1 з.3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, 5 что в качестве продуцента из.вида используютштамм Мсгогпопозрога чц 1 даг 1 з РА-4.4, Способ по пп. 1 - 3, отличающийся тем,что в качестве источника углерода и азота для данного штамма используют кукурузную 10 муку с добавлением к ней сухих кормовых дрожжей.