Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода fusаriuм и бактерий erwinia

)5 Е ИЗОБРЕТ ОПИС К ПАТЕНТ спал ьзованием Я. Основнымистимуляция ро роста фитопатоцгп и бактерий ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР(73) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН(56) Авторское свидетельство СССРМФ 853846, кл, А 01 й 63/00, 1977,Авторское свидетельство СССРМ 1621508, кл, С 12 М 1/20, 1990.(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ РЯЕОООМОИАЯРОТ)ОА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА,ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ И ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий Рзецс)огпопаз ряс)а, который может быть использован для получения бактериального препарата для защиты растений от фитопатогенныхгрибов рода Рцзаг)ц)т) и бактерий рода Епчпа или для стимуляции роста растений,Целью изобретения было получение нового штамма Рзецс)огпопаз рцт)са, обладающего способностью к подавлению роста фитопатогенных грибов рода Рзецбовопаз и бактерий Епдиа и стимуляции роста растений,Штамм Рзебыл выделен из цгопопаз рцэр)ба ВЯ 1380 рихосферы дикорастущих 2ГРИБОВ РОДА Г.)ЯАВОМ И БАКТЕРИЙ ЕЯЮ МА(57) Использование: может быть использован для получения бактериального препарата для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода Гцзагцгп и бактерий Епаиа, Сущность изобретения; штамм бактерий Рзецбоп)опаз рцтса ВКМ ВД выделен из ризосферы дикорастущих злаков в Армянской ССР. Хорошо растет на различных средах в том числе синтетических, в условиях аэрации при 30 С, рН 7,0 - 7,5. Для получения препарата штамм выращивают на МПБ до концентрации 10 кл/мл, Препарат обладает,9способностью к подавлению роста фитопатогенных грибов рода Ецзагаа, стимулирует рост растений, обладает способностью растворять минеральные фосфаты. 5 табл,злаков в Армянской ССР с иселективных сред Кинга В икритериями отбора служилиста растений и подавлениегенных грибов рода Ецзагрода Ега)па.Состав среды Кинга В (г/л);пептон - 20глицерин (мл) - 10М 9 ЯО 4 х 7 Н 20 - 1,5агар - 15Состав среды Я (г/л)сахароза в . 10глицерин (мл) - 10гидролизат казвина - 5МаНСОз - 1МЦЯ 04 х 7 Н 20 - 1К 2 НР 04 - 2,3саркоэил - 1,2триметоприм (мг) - 20агар - 15 5Штамм Рзецдогпопаз рцэрда ВЯ 1380 депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН под номеромВКМ ВД,Штамм Р.рцэрда ВКМ Вобладаетследующими свойствами:Культурально-морфологические признакиКлетки палочковидные, размером (2,2 -3,2) х (0,6 - 0,9) мк, подвижные, перитрихи, 15грамотрицательные, спор не образуют,Размеры клеток даны для односуточнойкультуры, выращенной на МПА при 30 град,Штамм хорошо растет на следующихсредах; МПБ (мясопептонный бульон), Кинга В: пептон - 20 г/л, глицерин - 10 мл/л,М 9504 х Н 20 - 1.5 г/л; на.минимальнойсинтетической среде М 9 следующего состава: К 2 НР 04 - 7 г/л, КН 2 Р 04 - 3 г/л,ЙН 4 С -1 г/л, глюкоза - 1 г/л, На мясопептойномагаре колонии гладкие, блестящие, с ровными краями,В мясопептонном бульоне наблюдаетсяпомутнение, осадок и желто-зеленый флуоресцирующий пигмент, 30На стандартных средах Кинга продуцирует желто-зеленый флуоресцирующий пигмент, фенаэиновые пигменты не образуют.Физиолого-биохимические признакиОблигатный азроб, температурный оптимум роста 28-30 С, не растет при 41 С,оптимум рН 7,0 - 7,5.Нитраты редуцирует, желатину не разжижает, молоко не пептонизирует, не использует в качестве источников углерода 40трегалозу и д-ксилозу, утилизирует этиловый спирт.Ассимилирует аммонийный и нитратный азот, В качестве источника углеродаиспользует д-глюкозу, д-фруктозу, сахарозу,мальтозу, лактозу, ацетат, пропинат, бутират. сукцинат, пируват, фумарат, бензоат,лактат, цитрат, катехол, протокатехоат.Оксидазная реакция положительная.Аргининдегидролаза присутствует 50 Условия хранения штамма:Штамм бактерий Рзецдогпопаз рцбда ВКМ ВД хранят на чашках. косяках с МПА, или со средой Кинга В при 5-7 С. 55 Пересевы на свежие среды - один раз в месяц. Может храниться не менее 1 года в 15 глицерине при -20-70"С, в лиофильновысушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром. или в полужидкой агаризованной среде под вазелиновым маслом следующего состава:Иц 1 гепе Вгой (О 1 со) - 4 г/лМаС 1 - 5 г/лагар - б г/лрН -6,8Штамм Р.рцэрда ВКМ ВЗД не патогенен и имеет генетическую метку - устойчивость к рифампицину (100-200 мкг/мл),что позволяет контролировать его приживаемость на корнях растений,Для инокулирования семян используютбиомассу клеток штамма Е.рц 1 Ыа ВКМ В 1743 Д, выращенную в жидкой среде КингаВ или в мясопептонном бульоне (МПБ) накачалке при 30 С в течение 16-18 часов, Обработку семян производят из расчета 10 - .б10 клеток на 1 г семян.П р и м е р ы 1-3, демонстрирующиеантагонизм штамма Е.рм 1 да ВКМ ВДв отношении фитопатогенных грибов родаЕцзагцв.П р и м е р 1. Штамм Р.рц 11 да ВКМВД выращивают на среде МПБ доплотности 10 кл/мл, 1 мл "ночной культуры" осаждают с помощью шприца М 11 рогена нитроцеллюлозный фильтр 0,45 мкмМ 11 роге, Фильтр помещают на чашку с сусло-агаром или средой Чапека, содержащейпредварительно внесенный мицелий.фигопатогенного гриба Ецзагцгп поп 1 Лога,Чашку инкубируют при комнатной температуре (25 С) в течение 3-4 суток и визуальнорегистрируют зоны подавления грибногороста вокруг фильтров, Зоны угнетения роста грибного мицелия штаммом Р.Рц 1 ЫаВКМ ВЗД вокруг фильтра составляют от12 до 17 мм.П р и м е р 2, Осуществляют аналогичнопримеру 1, но в качестве индикаторного фитопатогенного гриба используют РцзагцгпЬе 1 егозрогцт, Зоны угнетения роста грибного мицелия Е,Ье 1 егозрогцт штаммомЕ,рцэрда ВКМ ВД составляют от 10 дд15 мм,П р и м е р 3. Осуществляют аналогичнопримеру 1, используя в качестве индикаторного фитопатогенного гриба Ецзагцщзо 1 ап 1, Зоны угнетения роста мицелияЕ,зо 1 ап штаммом Е.рц 11 да ВКМ ВД составляют от 10 до 15 мм,П р и м е р ы 4 - б, демонстрирующиеантагонизм штамма Р.рц 11 да ВКМ ВЗДв отношении фитопатогенных бактерий рода Белп 1 а.П р и м е р 4. На чашку МПА высеваютштрихом штамм Р,рцтда ВКМ ВД ивыращивают при 30 С в течение 24 часов.Затем на поверхность чашки наносят с помощью пульверизатора суспенэию клеток40 45 растений на 82 и 63% соответственно. Защитный эффект достигается путем эффек 5055 Через 5 дней роста растений в климатической камере при 25 ОС сравнивают размеры контрольных (необработанных) и опытных растений (рис,4). Высота опытных растений на 5-е сутки составляет в среднем 103+ 6,5 мм, а контрольных - 50 й 15 мм.П р и м е р 9. Осуществляют аналогично примеру 8, используя, в отличие от примера 8, семена капусты сорта "Июньская". Скорость прорастания опытных растений также превышает скорость прорастания контрольных растений, Высота опытных растений на 7 сутки составляет 50+12 мм, э контрольных - 30+8 мм. Как видно из примеров 8 и 9, предлагаемый штамм Рз, рцт 1 да ВКМ ВД обладает способностью стимулировать рост редиса и капусты в гнотобиотических условиях, Таким образом, в предыдущих примерах показаны два типа стимуляции роста растений: непрямая или опосредованная стимуляция за счет подавления почвенных фитопатогенов; прямая стимуляция роста растений в.отсутствии фитопатогенов (гнотобиотические условия), по-видимому, за счет непосредственного воздействия штамма на растение, Одним из таких механизмов прямой стимуляции является. по-видимому, способность штамма растворять минеральные фосфаты. Стимуляция роста растений складывается из опосредованной стимуляции (эа счет подавления фитопатогенов) (пример 7) и прямой стимуляции в отсутствие фитопатогенов (пример 8,9).П р и м е р 10, Демонстрирующий способность штамма Р.рцт 1 да ВКМ ВД растворять минеральные фосфаты. Используется метод для идентификации растворения минеральных фосфатов бактериями Ега 1 п 1 а ЬегЫсо 1 а, Готовят среду, содержащую 2 оочищенного агара (рцгйед адаг 00 со); 1 оглюкозы, 0,1% М 9504, 0,1 оМаС 1 и 0,5 оМН 4 С 1, В качестве источника нерастворимого фосфата используют гидроксилапатит (ГАП), подготовленный следующим образом, ГАП стерилизуют автоклавированием, отмывают 10 раз стерильной бидистиллированной водой, высушивают и растирают в стерильных условиях до получения гомогенного пудрообразного порошка, К 100 мл минеральной среды добавляют 5 г порошка ГАП, доводят рН до 7,2 (1 Й 1 чаОН) и по 10 мл этой среды наслаивают в чашки Петри на 10 мл предварительно разлитого 1 оочищенного агара. В приготовленной таким образом среде содержание водорастворимых фосфатов составляет менее 1 мм. Культуры в 5 10 15 20 25 30 35 стационарной фазе роста высевают на чашки с указанной средой и через 48 часов регистрируют зоны растворения ГАП.Используемые в качестве положительного контроля 6 штаммов бактерий рода Ега 1 п 1 а очень слабо растворяют ГАП, Штаммы Е.со 11 В и Р.рМ 1 да 40 а не способны к растворению ГАП и росту на этой среде. Штамм Р.рцт 1 да ВКМ ВД хорошо растет и на этой среде образует прозрачные зоны растворения ГАП.П р и м е р 11. Действие препарата на основе штамма Р.рцт 1 да ВКМ ВД на инфицированные фитопатогенными грибами рода Рцзаг 1 цгп растения.Семена огурцов сорта "Тепличный" и томатов сорта "Черный принц" инокулируют в суспензии штамма, как указано выше. Предварительно готовят почву, инфицированную фитопатогенными грибами, В стерильную почву (простерилизованную автоклавироеанием в течение 1 часа при 1 атм.) вносят гомогенизированную и разведенную в 100 раз смесь 5-суточного мицелия фитопатогенных грибов Гцзаг 1 цгп Ьесегозрогцгп, Г,гпоп 10 оггп, Г.зо 1 ап 1 из расчета 100 мл суспензии на 500 г стерильной почвы.Семена огурцов и томатов, инокулированные бактериальной суспензией и контрольные - , неинокулированные, высаживались в горшки с инфицированной почвой в 12-ти повторностях. Через 10 - 20 дней роста в климатической камере проводят учет заболевших растений, имеющих типичные признаки корневых гнилей и фузариозного увядания. Данные этого эксперимента представлены в табл.3,Как видно из табл,З, обработка семян огурцов и томатов штаммов Р,рм 1 да ВКМ ВД в условиях искусственного фитопатогенного фона уменьшает заболеваемость тивной колонизации корней растений клетками штамма Р.рцт 1 да ВКМ ВД и супрессии этим штаммом грибов рода Рцзаг 1 цп. Штамм Р.рцбда АКМ ВД показал высокую проживаемость на корнях растений. К концу эксперимента титр штамма составлял в среднем 10 клеток на 1 г6корня.П р и м е р 12, Использование препарата на основе штамма Р,рцт 1 да ВКМ ВД для защиты капусты в условиях естественного фитопатогенного фона.Семена капусты сортов "Слава", "Подарок","Дауэреайс" обрабатывают суспен10 15 20 25 30 вание культуры осуществляют при 30 С накачалке (250 об/мин) в течение 12-16 часовдо конечного титра (3-5) х 10 клеток/мл. 509При необходимости суспензию клеток раз 55(10 кл/мл) фитопатогенных бактерий Я Егю 1 п 1 а саго 1 очога чаг, сагосочога. Госле инкубирования чашек в течение 24 часов при ЗООС визуально регистрируют зоны подавления роста фитопатогенных бактерий вокруг штриха штамма Р.рцс 1 ба ВКМ ВД. На рис,2 представлено подавление роста фитопатогенного штамма бактерий Егчч, саго 1 очога наг, сагосочога нЕСколькими штаммами-антагонистами из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН, в том числе и штаммом Р.рцэр ба ВКМ В 1743 Д. Зоны угнетения роста фиЪопатогенных бактерий Егч.Сагосонога чаг. сагосочога штаммом Р.рыба ВКМ ВД составляют 8-12 мм, чтоуказывает на антагонизм штамма Р,рц 1 са ВКМ ВД в отношении этого вида фитопатогенных бактерий,П р и м е р 5. Осуществляют аналогичнопримеру 4, используя в качестве индикаторных фитопатогенных бактерий штамм Егъ,саготочога чаг.асгозербса, Зоны угнетения роста этих фитопатогенных бактерий штаммом Р,рмЫа ВКМ ВДсоставляют 10-13 мм, что показывает антагонистические возможности штамма Р.рцэрга ВКМ ВД в отношении фитопатогенных бактерий Егчч, саго 1 онога наг.а 1 гозер 1 са,П р и м е р 6. Осуществляют аналогично примеру 4, используя в качестве индикаторной культуры фитопатогенные бактерии Егч.йегЫсо 1 а, Зоны угнетения роста Егч,ЬегЬсоа штаммом Р,рц 11 са ВКМ. В 1743 Д составляет 10-12 мм, что также указывает на антагонизм штамма Р,рцтЫа ВКМ ВД в отношении этого вида фитопатогенных бактерий,П р и м е р 7, демонстрирующий способность штамма Р.рц 11 с 1 а ВКМ ВД подавлять рост фитопатогенов в ризосфере огурцов.Семена огурцов сорта "Тепличный" инакулируют в суспензии клеток штамма, как указано выше, Суспензию готовят следующим образом; в колбы емкостью 750 мл заливают 250 мл стерильной среды Кинга В или МПБвносят в нее стационарную культуру штамма в количестве 1 - 2 мл. Выращибавляют Ка-фосфатным буфером (рН 7,0) или водопроводной водсй, Предварительно готовят почву с естественным фитопатогенным фоном, взятую из очагов гибели огурцов от корневых гнилей. В зараженную почву высевают обработанные и контрольные - необработанные семена. Через 2 недели роста в климатической камере при 25 С сравнивают размеры опытных и конт 35 40 рольных растений. Как видно из табл,1, обработка семян клетками штамма Р,рцООаВКМ ВД приводит к двукратному увеличению всех параметров роста огурцов вусловиях фитопатогенного фона.В примере показано, что обработка семян огурцов суспензией клеток штаммаприводит к увеличению роста огурцов в условиях фитопатогенного фона, Т,е, показансупрессирующий эффект инокуляции штаммом Р.рц 11 са ВКМ ВД в естественныхусловиях, Данная почва показывает прианализе высокий фон фитопатогенных грибов и бактерий с преобладанием грибов роста Гцзаг 1 цгп. Инокубированные инеинокулированные семена огурцов сорта"Тепличный" высевают не только в почву сестественным фитопатогенным фоном, но ив стерильную почву (простерилизованнуюавтоклавированием в течение 1 часа. при 1атм), При этом получают следующие данные, представленные в табл.2.Сравнение этих данных с даннымитабл,1 показывает, что стерилизация почвыприводит к эффекту, сравнимому с эффектом бактеризации семян в условиях фитопатогенного фона, Бактеризация семян вусловиях стерильной почвы дает незначительный стимулирующий эффект, Это указывает на то, что основным механизмомстимуляции в этом эксперименте являетсясупрессия почвенных фитопатогенов штаммом Р,рмса ВКМД,Примеры 8,9 демонстрируют способностьштамма Р.раЫа ВКМ ВД стимулироватьрост растений в гнотобиотических условиях,П р и м е р 8, Семена редиса сорта"Тепличный" обрабатывают в течение 30мин. 10% раствором НгОг и проверяют настерильность, выдерживая на чашках сМПА. Нестерильные семена, образующиена МПА зоны бактериального или грибногороста, выбраковывают. Обработку стерильных семян штаммом Р.рИса ВКМ ВДпроводят как в примере 7, Семена высеваютв пробирку со стерильной средой следую- .щего состава: (на 1 л).СаС 1 г х 2 НгО 0,44 гККОз .1,9 гК 1 0,83 мгСа(КОЗ)г х 6 НгО 0,036 мгКНгРО 4 0,17 гКзВОз 6,2 мгКагМо 04 х 2 НгО 0,25 мгМ 9 ЯО 4 х 7 НгО 0,37 гМпЯО 4 х 4 НгО 22 гмСцЯ 04 х 5 НгО 0,025 мгЕпЯО 4 х 7 Нг 0 8,6 мгРеЯ 04 16,5 мгКаг х ЭДТА 16,7 мг10 1805849 Таблица 1 Влияние предпосевной обработки семян огурцов штаммом Р,рц 1 Ыа ВКМ ВЗД на рост растенийзией штамма ВКМ ВЗД, как указано выше, В дальнейшем проводят три обработки вегетирующих растений в следующих фазах роста: первая - 5-7 настоящих листьев; вторая - завязывание кочана; третья - средне го кочана. Обработку проводят суспензией клеток плотностью 10 кл/мл пвои средней инокуляционной нагрузке Зх 10 клеток на одно растение. Эксперимент проводят в условиях высокого естественного фитопато генного фона, включающего грибы рода Рцзагцгп. Результаты эксперимента представлены в табл,4,Обработка семян и вегетирующих растений препаратом штамма приводит к снижению заболевания капусты, вестественных условиях на 17%,П р и м е р 13. Бактерий рода Егччп 1 аявляются основным возбудителем корневой 20гнили картофеля.Проверка эффекта обработки картофеляштаммом ВКМ-В 1743 Д проводилась также в,естественных условиях, т.е. на природном базальном фоне почвенных патогенов. 25 Исследования проводились нэ картофеле сорта "Невский", Клубни обрабатывали с использованием рэспылительной установки, Норма расхода бактериальной суспенсзии плотностью 10 кл/мл составляла 0,5 л на 1 т посадочного материала, Посадочный материал весом 3,6 т высажен нэ опытном участке площадью 0,4 га.Конечный показатель - урожай картофеля с опытного участка, Данные сравнения урожая с опытного й контрольного участка той же площади представлены в табл,5.Таким образом штамм Рзецдотопаз рцтЫа ВКМ ВД обладает способностью к подавлению роста фитопатогенных грибов: Ецзаг 1 цт топ 111 Фоггп 1, Рцзаг 1 цп Ьесегозрогцв, Рцзаг 1 цгп зоап 1 и бактерий Епм 1 п 1 а саго 1 очога чаг, саго 1 очога, Елм 1 п 1 а сагосочога чаг, а 1 гозрбса, Егчч 1 п 1 а ЬегЫсоа. Штамм не токсичен, не патогенен по отношению к растениям, обладает стимулирующим действием на рост растений, снижает заболеваемость при инфекции фитопатогенными грибами рода Рцзог 1 цв,.обладает способностью растворять минеральные фосфаты, что позволяет использовать этот штамм для создания на его основе препарата, предназначенного для стимуляции роста растений и защиты их от грибов рода Гцзэг 1 цгп и бактерий рода Ею 1 па.Формула изобретения Штамм бактерий Рзецдогпопаз рц 1 Ыа ВКМ ВД для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода Гцзагцт и бактерий Ега 1 п 1 а,1805849 12 Таблица 2 Влияние предпосевной обработки семян огурцов штаммом Р.рцтЫа ВКМ ВД на рост растений в стерильной почвеаблиц щитный эффект штамма Р, ротда ВКМ ВЗД в услови ях искусственного фитопатогенного фонаТаблица щитный эффект штамма Р.ромба ВКМ ВЗД в условиях1естественного фитопатогенного фона блица Составитель О. КрасниковаРедактор А,Павловская Техред М.Моргентал Карре ил аказ 9 ВНжгород, ул,Гагарина, 101 изводственно-издательский комбинат "Пате Тираж ПодписноеПИ Государственного комитета по иэобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5