Способ получения ферментов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИН ав 811ц 11 5 ц 4 А 6 К 37/4 3 -.У: ОП ИЗОБРЕТЕН ВИДЕТЕПЬСТВ К АВТОРСК ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ:Биохимреактпв, Всесоюзный научно-исслев вательский институт прикладной биохимиии Куйбышевский медицинский институтим. Д. И. Ульянова(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕ МЕНТОВ, включающий экстрагирован скелетной мышцы кролика, обработку полученного экстракта сульфатом аммония с последукнцими выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью одновременного получения альдо- лазы глицерофосфатдегидрогеназы и глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы, экстракцию ферментов проводят 0,03 - 0,035 М раствором однозамещенного фосфорнокислого калия при рН 8,1 - 8,3, а обработку экстракта сульфатом аммония проводят при насыгцении до 32,4 - 33%, после чего осадок отделяют и к супернатанту добавляют сульфат аммония до 39,6 - 40%, образовавшийся осадок, содержащий альдолазу и глицерофосфатдегидрогсназу, отделяют, а супернатант обрабатывают сульфатом аммония до 48,9 - 49% и выделяют глицеральдегидрофосфат- дегидрогеназчИзобретение относится к энзимологии и может быть использовано для получения ферментных препаратов, которые находят широкое применение в качестве химических реагентов в биохимической практике, в технологии лекарственных веществ, а также для энзимодиагностики и энзимотерапии.Цель изобретения - одновременное получение альдолазы глицерофосфатдегидрогеназы и глиперальдегидрофосфатдегидрогеназы.Пример /, 1. Мышцы кролика, взятые сразу после обескровливания, хорошо охлаждают на льду, освобождают от жировой, соединительной тканей и измельчают на мя сорубке.11. Экстрагирование. Измельченные мьпппы в количестве 500 г смешивают с двукра 1- ным количеством О,ОЗ М раствора одпозамс 1 пенного фосфорнокислого калия (рН 8,1), содержащим ЭДТА (500 мг/мл), и оставляют при 04"С на 3040 мин при частом перемешивании: Затем экстракт отделяют от твердых частей путем фильтрации через марлю под давлением.111. Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту добавляют насыщеный раствор сульфата аммония до концентрации 32,40/О насыщения от объема в течение 40 - 60 мин при 0 - 4 С. Насыщенный раствор сульфата аммония добавляют небольшими порциями. Образовавшийся осадок балластных белков отбрасывают пснтрифугированием при 2000 - 2500 д в течение 15 - 20 мин прн 0- - 4 С.К пентрифугату добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до концентрации 39,6%. Центрифугируют при 2500 - 4500 д в течение 7 - -1 О мин.1 Ъ. Стаоилизация и кристаллизация альдолазы. Осадок, содержащий значительное количество альдолазы, растворяют в 5 мл О,ОЗМ раствора однозамешенного фосфорнокислого калия, содержащего ЭДТА в концентрации 500 мг/л, при 0 - 4"С, рН раствора 6,4 - 6,6; добавляк)т 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония (рН 7,5 - 7,6), Кристаллизация адьдол азы протекает в 3,2 М растворе сульфата аммония в течение 3 - 4 дн. при 0 - 4 С.Перекристаллизация альдолазы. Первичные кристаллы собирают центрифугированием при 3500 - -5000 д в течение 57 мин. Растворяют в 2 мл охлажденной бидистиллнрованной.воды или в охлажденном О,ОЗМ растворе однозамешенного фосфорнокислого калия, Добавляют 3 мл насьппенного раствора сульфата аммония рН 6,2 - 6,4.Выход 150 мг из 0,5 мг мьппп. Активность не менее 15,5 Е/мг белка.Сохранякт препарат в виде суспензии в 3,2 М растворе сульфата аммония в теченис 8-12 мсс при О - 4 С.1 олучс ние глиперофосфатдегидрогеназы. Кристаллизация. 1 осле центрифугирования и отделения альдолазы в надосадочной. жидкости (1 у этап) при 20 С через 10 - 12 чпри рН 6,2 - 6,4 кристаллизуется глицерофосфатдегидрогеназа.Перекристаллизация. Кристаллы глицерофосфатдегидрогеназы отделяют центрифугированием при 3500 в 50 д в течение5 - 7 мин, Растворяют их в 2,0 - 2,5 мл холодной бидистиллированной воды. Добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (рН 6,0 - 6,2) в количестве 3 мл. Рекристаллизация протекает при 0 - 4 С и заканчивается спустя 2 - 3 дн,Препарат глицерофосфатдегидрогеназысохраняется в виде суспензии в 3,2 М растворе сульфата аммония в течение 8 - 12 меспри 0 - 4 "С без существенных потерь активности.Выход 51 мг из 0,5 кг мышц. Активность10 Е/мг белка.у 1, Получение глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы.Центрифугат после отделения осадка,содержащего альдолазу и глицерофосфатдегидрогеназу (этап 111), насыщают до 48,90/Одобавлением насыщенного раствора сульфата аммония, рН 5,6 - 5,9. Образовавшийся осадок фильтруют через складчатый бумажный фильтр.Кристаллизация дегидрогеназы фосфоглицеринового альдегида протекает при 20 С в30 фильтрате. Начинается через 8 в 10 ч и завершается через 2 - 3 дн.Перекристаллизация. Первичные кристаллы отделяют центрифугированием при3500 - 5000 д в течение 5 - 7 мин. Осадокрастворяют в 3 - 4 мл охлажденной бидистиллированной воды и добавляют равныйобъем насыщенного раствора сульфата аммония, рН 5,7 - 5,8.Рекристаллизация происходит при 0 - 4 С,завершается через 2 - 3 дн.4 Хранение глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы осуществляют в суспензии 2,2 Мраствора сульфата аммония при 0 - 4 С втечение 12 - 24 мес. без существенных потерь активности фермента.Выход 200,5 мг из 0,5 мг мышц. Актив 45 ность 18,6 Е/мг белка.Пример 2. 1. Подготовку сырья проводятаналогично примеру 1.1. Экстра ги рова и ие. Измельченные м ы щцы в количестве 500 г смешивают с двукратным количеством 0,032 М раствора однозамегценного фосфорнокнслого калиярН 8,2, содержащим ЭЛТА (500 мг/л), и оставляют при 0 - 4"С на ЗО - 40 мин при частом перемешивании. Затем экстракт отделяют от твердых частей путем фильтрации че 55 рез марлк под давлением.111. Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту добавляютнасыщенный раствор сульфата аммония до1171037 Составитель В. Ьрсилонская Техред И. Верес Корректор М. Максимишинен Тираж 722 11 одниснос ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород. ул. Проектная, 4Редактор В. ПетрашЗа к аз 4764/3 32,6% насыщения от объема в течение 40 - 60 мин при 0 - 4 С. Далее так же, как в примере 1.К центрифугату добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 39,8% насыщения. Центрифугируют при 2500 - 4500 д в течение 7 - 10 мин.17 - И этапы. Стабилизация и кристаллизация альдолазы и получение ГФД и ГАФД проводятся аналогично примеру 1.Выход альдолазы 152 мг из 0,5 кг мышц: Активность альдолазы 17 Е/мг белка.Выход ГФД 52 мг из 0,5 кг мышц. Активность ГФД 10 Е/мг белка.Выход ГАФД 200 мг из 0,5 кг мышц. Активность ГАФД 20 Е/мг белка.Пример 3. 1. Подготовку сырья проводят аналогично примеру 1.11. Экстрагирсвание. Измельченные мышцы в количестве 500 г смешивают с двукратным количеством 0,035 М раствора однозамещенного фосфорнокислого калия рН 8,3,содержащим ЭДТА (500 мг/л), и оставляют при 0 - 4 С на 30 - 40 мин при частом перемешивании. Затем экстракт отделяют от твердых частей путем фильтрации через марлю под давлением.111, Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 33% насыщения от объема в течение 40 - 60 мин при 0 - 4 С.К центрифугату добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 40/о. Центрифугируют при 2500 - 4500 д в течение 7 - 10 мин.И - Л этапы проводят аналогично примеруВыход альдолазы 151 мг из 0,5 мг мышц. Активность альдолазы 15 Е/мг белка.Выход ГФД 50,5 мг из 0,5 кг мышц. Активность ГФД 10 Е/мг белка.Выход ГАФД 201 мг из 0,5 кг мышц. Активность ГАФД 20 Е/мг белка.