Способ выявления нуклеотидных последовательностей

)5 С 122 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОбРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ К АВТОРСКО ЕЛЬС СВ- 1(71) Всесоюзный научноинститут биологическог(53) 575,224,2:577.2 (088156) ТаПсоа ЯМове еу Я1 п д 1 а 9 позс 1 с Гп 1 сгоЫо 11982, М 4358535,исследовательскииприборостроенияВ.Домарадский и ресйс Ойа рготег у. - ОБА Ратепс,относитсет быть и збудителе тификаци учных ис тения - ус стоверно ения веро екулярнои овано для кционныхоорганизниях.е способа результа- неспеция к молспользй инфе и микр ледова корени ти его ятности ии нуклеотидных последомплементарных нуклеотидтельностям эталонного рительно на поверхность т один или несколько эта, а специфическую метку твенно в исследуемый маи его нуклеотидных послествляют следующим о(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Изобретение биологии и мож диагностики во болезней, иден мов, а также в на Цель изобре и повышение до тов за счет сниж фических реакци При выявлен вательностей, ко н им последова образца, предва носителя нанося лонных образцов вводят непосредс териал без очистк довательностей. Способ осущеЭталонные образцы предварительно вносят на поверхность носителя, фиксирут их тепловой обработкой и предгибриди(57) Изобретение относится к молекулярной . биологии и может быть использовано для диагностики возбудителей инфекционных болезней, идентификации микроорганизмов, а также в научных исследованиях, Цель изобретения - ускорение способа и повышение достоверности его результатов за счет снижения вероятности неспецифических реакций. Предварительно на поверхность носителя наносят один или несколько эталонных образцов, а специфическую метку вводят непосредственно в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей,зуют, Маркированию, например сульфированию, подвергают исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей непосредственно в процессе лизиса бактериальных клеток или тканей, инфицированных вирусами, Общее время обработки и маркировки исследуемого материала до его взаимодействия с фиксированными на носителе эталонными образцами занимает 3 ч. Носитель с эталонными образцами подвергают взаимодействию с маркированным исследуемым материалом и отмывают избыток материала. Факт комплементарного взаимодействия нуклеотидн ых последовател ьн остей эталонного образца и исследуемого материала устанавливают иммуноферментным методом,П р и м е р 1. Бактериальную культуру штамма Е.со 1 Тб 1 с плазмидой рТЕ 188 выращивают с аэрацией при 37 С в-бульоне, содержащем 30 мкг/мл ампициллина, до концентрации 2 х 10 кл,/мл. Бактериаль- вную культуру лизогенного по фагу Л штамма Е.со СЯН 45 (, С 185757) выращивают аналогичным образом в-бульоне без антибиотика. Бактериальную культуру штамма В.зоЬОз 168 выращивают в Е-бульоне до насыщения (до концентрации 2 х 10 кл/мл). Клетки из 1 мл каждой бактериальной культуры осаждают центрифугированием при 2000 ц в течение 5 мин и суспендируют в 0,2 мл ТЭН-буфера, содержащего 0,05 М трисНС 1, 0,001 М ЭДТА, 0,025 М натрия хлори- стого, рН 8,0, Такие суспенэии клеток используют в качестве исследуемого материала. Все дальнейшие операции, кроме специально укаэанных, проводят при комнатной температуре,Для обработки и маркировки исследуемого материала предлагаемым способом к суспензии клеток прибавляют 0,05 мл раствора лизоцима в ТЭН-буфере с концентрацией 4 мг/мл. Через 10 мин добавляют 1,35 мл лизирующего раствора, содержащего 6,0 М гуанидинхлорида, 0,1 М ЭДТА, 0,05 М трис-НС, рН 8,0, и перемешивают в течение 5 мин до полного лизиса клеток. Прогревают лиэат при 65" С в течение 10 мин, затем пять раз пропускают лизат через иглу с помощью шприца на 5 мл. К лизату добавляют 2 мл раствора 1,0 М метилгидроксиламина, рН 6,0 и 8 мл раствора 2,0 М метабисульфита натрия, рИ 6,0, Через 1,5 ч прибавляют 11,6 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 15 мин. Затем осаждают сульфированные нуклеотидные последовательности центрифугированием при 5000 ц в течение 15 мин, Осадок дважды промывают 70%-ным этиловым спиртом, высушивают на воздухе в течение 15 мин и растворяют сульфированные нуклеотидные последовательности в 0,05 мл ТЭН-буфера, Общее время подготовки исследуемого материала к реакции комплементарного взаимодействия с эталонными образцами составляет 3 ч.Для сравнения исследуемый материал обрабатывают на носителе - нитроцеллюлозном фильтре в соответствии с известным способом. Суспензию клеток наносят на поверхность нитроцеллюлоэного фильтра, лиэируют раствором 0,5 М гидроокиси натрия в течение 10 мин, нейтрализуют раствором 1,5 М натрия хлористого, 1,0 М трис-НС, рН 7,0 в течение 13 мин, затем фиксируют тепловой обработкой при 65 С в течение 2-12Предгибридизацию проводят путем инкубации фильтра при 37 С в течение 3 ч в 10 мл гибридизационного раствора, содержащего 50% формамида, 5 хССР (1 хССР соот 20 25 30 ветствует раствору 0,15 М натрия хлористого, 0,015 М натрия лимоннокислого), 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% овальбумина, 0,1% додецилсульфата натрия, 75 мкг/мл денатурированной прогреванием при 100 С и фрагментированной ультразвуком ДНК тимуса теленка, Общеевремя подготовки исследуемого материала на носителе составляет 5,5 - 15,5 чПо 0,2 мл растворов овальбумина с концентрацией 1 мг/мл в ТЭН-буфере и ДНК тимуса теленка с концентрацией 1 мг/мл вГЭН-буфере подвергают такой же физико- химической обработке предлагаемым способом, как и бактериальные клетки.Полученные препараты используют в качестае контрольных.На нитроцеллюлозный фильтр наносят в виде отдельных точек по 0,01 мл растворов сульфированных нуклеотидных последовательностей из бактериальных клеток и контрольных препаратов ДН К тимуса теленка и овальбумина, Фильтр высушивают на воздухе в течение 30 мин,Для выявления маркированного исследуемого материала и контрольных препаратов используют иммуноферментный метод, Фильтр помещают в 10 мл раствора для блокировки, содержащего буфер ФСБ следующего состава: 0,007 М натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,003 М натрияфосфорнокислого одноэамещенного, 0,12 М натрия хлористого. 0,02% глицияа, 0,3%Твин, рН 7,4, с добавлением овальбумина до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Через 30 мин фильтр переносят в 10 млбуфер ФСБ, содержащего коньюгат иммуноглубулйнов кролика против сульфированной ДНК с перексидазой хрена в разведении 1;200 и выдерживают в течение 1 ч, Фильтр отмывают три раза по 10 мин, каждую поомывку проводят в 20 мл буфера ФСБ, Затем фильтр погружают в 5 мл раствора хромогенного субстрата, содержаще 45 го 0,2% бензидина, 0,4 М аммонияхлористого, 3% перекиси водорода, 0,02 М ЭДТА, рН 6,0, Выдерживают 20 с, затемфильтр промывают водой и высушивают навоздухе в течение 15 мин, Оценку результатов проводят визуально, считая за положительный появление сине-голубой окраски.Иэ результатов следует, что иммуноферментным методом выявляются нуклеотидные последовательности исследуемого материала и контрольной ДНК, но не выявляется препарат контрольного белка,Представленные данные свидетельствуют, что предлагаемый способ позволяет вводить специфическую метку в исследуемый материал без очистки его нуклеотидныхпоследовательностей. При этом маркирование белка, составляющего основную часть примесей, не происходит. Общее время подготовки исследуемого материала к реакции комплементарного взаимодействия с эталонными образцами предлагаемым способом по сравнению с известным сокращается по меньшей мере на 2,5 ч.П р и м е р 2, В качестве эталонных образцов (зондов) используют ДН К плазмиды рТЕ 188 и фага А. Для денатурации ДНК растворы зондов с концентрацией 0,2 мг/мл в ТЭН-буфере прогревают при 100 С в течение 10 мин, На три нитроцеллюлозных фильтра наносят в виде отдельных точек по 0,01 мл растворов зондов. Фиксацию зондов на фильтрах и предгибридизацию проводят в соответствии с известным способом. В качестве исследуемого материала используют суспензии бактериальных клеток штаммов Е,со Тб 1(рТЛ 188), Е,со 1 СЯН 45 ( Х С 85757) и Вас.зцЬйэ 168, обработанные и маркированные по методике, описанной в примере 1. Фильтры с фиксированными эталонными образцами помещают в полиэтиленовые пакеты и вносят в каждый по 1 мл гибридизационной смеси, содержащей 0,95 мл гибридизационного раствора и 0,05 мл одного из препаратов маркированного исследуемого материала, Пакеты запаивают и инкубируют при 37 С в течение,24 ч. Удаляют из пакетов гибридизационные смеси. Фильтры отмывают в течение 45 мин, инкубируя их при 65 С в 200 мл раствора 5 хССР, 0,1; додецилсульфата натрия, затем 5 мин в растворе 2 хССР при комнатной температуре, Фильтры высушивают на воздухе в течение 30 мин.Инкубацию фильтров в растворе для блокировки и в растворе конъюгата иммуноглобулинов кролика против сульфированной ДНК с пероксидазой хрена, отмывку фильтров и окрашивание комплементарных нуклеотидных последовательностей в растворе хромогенного субстрата проводят, как описано в примере 1.Как следует из полученных данных, окраска появляется лишь в точках фиксации эталонных образцов, комплементарных нуклеотидных последовательностям маркированного исследуемого материала. Некомплементарные нуклеотидные последовательности предлагаемым способом не выявляются,Таким образом, предлагаемый способдействительно позволяет выявлять в иссле 5 дуемом материале нуклеотидные последовательности, комплементарные эталоннымобразцам, и применим для идентификациикак бактерий, так и вирусов, По сравнениюс известным способом, предлагаемый спо 10 соб за счет снижения вероятности неспецифических реакций не дает ложноположительных результатов и они имеютоднозначную интерпретацию,Преимущества предлагаемого способа15 перед известным - ускорение анализа и повышение достоверности его результатовпутем снижения вероятности неспецифических реакций - достигаются за счет другихотличительных признаков - маркировки ис 20 следуемого материала (сульфирование) безочистки его нуклеотидных последовательностей и гибридизации маркированного материала с предварительно фиксированнымина носителе эталонными образцами,25 Использованный метод детекции результатов гибридизации является качественным и не позволяет определятьколичество гибридных нуклеотидных последовательностей, Г)днако этот метод ис 30 пользован лишь для иллюстрации принципиальной осуществимости предлагаемогоспособа и не является единственно возможным.Формула изобретения35 Способ выявления нуклеотидных последовательностей, включающий подготовкуносителя, исследуемого материала, эталонного образца, введение метки, проведениереакции комплементарного взаимодейст 40 вия на поверхности носителя нуклеотидныхпоследовательностей исследуемого материала и эталонного образца с последующейрегистрацией результатов по наличию метки в продукте взаимодействия, о т л и ч а ю 45 щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа и повышения достоверности его результатов за счет снижения вероятностинеспецифических реакций, в качестве исследуемого материала используют лизат кле 50 ток, метку вводят непосредственно вполученный лизат, а для проведения реакции на носитель наносят эталонный образец, а затем меченый исследуемыйматериал.