Способ определения активности рибофлавинкиназы

)с С 12 (1 1/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯВТОРСЯОМУ СВИДЕТЕПЬСТВУ 34/13 21) 466 22) 23, 46) 28, 71) Льв иохими.91. Бюл цо 8ение Инст овское отдели им. А,В. ПВ,Е, Кащенко,и А.А.Сибирный577,15,08,(088Кащенко В.Е. ика и свойстваей Р 1 с 1 па рц 1мия, 1976, т,алладина ,Н,Преображ(72) ская (53) М,азы Шавловский ибофлавинк 1 егшопйх 1, 1, 1 2, с. чис дрожж Биохи 383 376 МауЬеч Б.С., Уаяя 1 п 1 с гпшоця й 1 цогошегг 1 с ая чо 1 схпаяе. Ргорегг 1 ея оГ Йгош РерСояггевососсця В 1 осЬып 1 са ег ВюрЬуя 1 с ч, 482, р. 341-347..1.Н. А сопау Гог Е 1 аЕ 1 ачок 1 паяе е 1 яс 1 еп 1.Асга, 197 ИВНОС ельн У ак Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в научноисследовательских лабораториях и в микробиологической промьппленности для определения активности фермента рибофлавинкиназы (АТФ:рибофлавин- фосфотрансферазы, К,Ф, 2.7,1.26). Рибофлавинкиназа катализирует реакцию фосфорилирования рибофлавина с образованием рибойлавинв ,фосфата-флавинмононуклеотида (ФМН) т.е. осуществляют первую реакцию превращения витамина В в коферментные формы - ФМН и флавинадениндинукпеотид (ФАД), которые входят в качестве простетических групп в состав целого(57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения активности ферментов, а именно рибофлавинкиназы (АТФ:рибофлавин -фосфотрачсферазы, КФ, 2,7.1,26). Целью изобретения является упрощение и удешевление способа. Способ заключается в том, что инкубацию исследуемой пробы, содержащей рибофлавинкиназу, проводят в присутствии рибо" флавина, аденознн-трифосфата и-ионов МВ, а количество,образовавшегося ФМН определяют флуориметрией пробы после удаления из нее чепрореагировавшего субстрата-рибофлавина при помощи транспорта этого вещества в клетки дрожжей Р 1 сЬ 1.а 8 цПегшопйЫ ВКПМ 4-432, содержащих высокоактивную и специфичную к рибофлавину транспортную систему - рибофлавинперлиазу, 1 ил., 1 табл. р окислительно-восстановит ыхф р ентов - флавопротеинов.Цель изобретения - упрощение идешевление способа,Способ заключается в том, что инкубацию исследуемой пробы. содержащейрибофлавинкиназу, проводят в присут/ствии рибофлавина, аденозин- .трифосфата (АТФ) и ионов МВ , а количество2+образовавшегося ФМН определяют флуо- ,)ЪРрометрией пробы после удаления из неененрореагировавшего субстрата - рибофлавина при помощи транспорта этоговещества в клетки штамма дрожжейР 1 сЬха рпП 1 егтпопйй .ВКПМ У,содержащих высоко тивную и специфич 1631089ную к рибойлавину транспортную систему - рибойлавинпермеазу,Способ заключается в разделении не вступившего в реакцию с рибрфла 5 винкиназой субстрата в рибофлавина и образовавшегося продукта реакции- ФМН в результате связывания рибойлавина высокоспецийичной рибойлавинпермеазой с последующим эййективным транспортом рибойлавина в клети дрожжей. Рибофлавинпермеаза Р.Еи 1111 егшопдЫ способна транспортировать в клетки дрожжей свободной рибойлавин и некоторые синтетические аналоги этого витамина, но не проявляет активности в отношении йосйорилированной формы рибойлавина, а именно рибофлавин-фосйата-флавинмононуклеотида. После поглощения рибойлавина введенными в реакционную смесь дрожжевыми клетками он легко удаляется из реакционной смеси при помощи простых и доступных методов отделения клеток от жидкой йазы: центрийугированием, йильтрованием и т.д. После этого активность рибойлавинкиназы определяется непосредственным измерениемфлуоресценции исследуемой пробы по количеству образовавшегося в рибофлавинкиназной реакции ФМНОпределение. активности рибофлавинкиназы согласно способу проводится не по уменьшению количества субстрата - рибофлавина, а по накоплению продукта ФМН, что является необходи 35 мым условием при определении низких активностей исследуемого фермента. Рибофлавинкиназа относится к таким ферментам, содержание которых в клетках микроорганизмов, в тканях растений и животных невелико и составляет Зх 10 -. Зх 10 4 Е/мг белка.Способ осуществляют следующим образом. , 45Составляют реакционную смесь для определения активности рибойлавинкиназы, содержащая рибофлавин, АТФ, ионы М 8 и компоненты буферной системы для создания оптимального значения рН; смесь прибавляют к исследуемой пробе и инкубируют, реакцию, останавливают термоинактивацией йер-, ментного белка, в реакционную смесьЪвводят дрожжевые клетки и пробу инкубируют в течение определенного промежутка времени, после чего клетки1 удаляют и активность рибофлавинкиназы определяют йлуорометрией пробы,) На чертеже приведен график зависимости йлуоресценции реакционной смеси от активности рибойлавинкиназы в измеряемой. пробе.Активность фермента определяют в реакционной смеси, содержащей рибофлавин в концентрации Зх 10 М, АТФ - 3 х 10 М, М 8804 1 х 10 М и 0,02 МИа - фосфатный буйер рН 8,0. Пробы инкубируют в течение 1 ч при 37 дС и прогревают на кипящей водяной бане 5 мин. К охлажденным пробам добавляют дрожжевые клетки из расчета 10 мг клеток (сухой вес) на 1 мл пробы, после чего пробы инкубируют с перемешиванием 30 мин при 30 С и удаляют осадок центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3 мин. В полученной надосадочной жидкости определяют концентрацию ФМН флуорометрией пробы на электрофлуориметре ЭФ-ЗМ. Интенсивность флуоресценции исследуемой пробы возрастает линейно в зависимости от содержания рибофлавинкпназы в пробе в диапазоне от 4 х 10 до24 х 10 Е/пробу (см,чертеж). За единицу активности (Е) рибофлавинкиназы принято количество фермента, необходимое для синтеза 1 мкмоль ФМН за 1 мин при 37 С. В таблице приведены данные, полученные в результате определения активности рибойлавинкиназы в бесклеточных экстрактах ряда видов микроорганизмов, а также в частично очищенных препаратах этого фермента, полученных из штамма дрожжей Р.8 ц 11 егшопйд АТСС 9058. Активность рибофлавинкиназы в эксперименте определяли двумя способами: 1 - предлагаемым способом, 2 - способом, основанным на хроматографическом разделении субстрата и продукта рибофлавинкиназной реакции. Как видно из полученных данных, значения активности йермента в исследуемых пробах в обоих случаях определения практически не отличаются.Клетки штамма дрожжей Р.Еи 111 ег" шопй 1 д ВКПМ У, содержащие рибофлавиннермеазу, легко получить культивированием на простых минеральных средах с добавлением в качестве источника углерода углеводов (глюкозы, сахарозы), этилового спирта или парафинов нефти. Полученная биомасса дрожжей хорошо сохраняется в охлажденном состоянии без существенной потери рибофлавинпермеазной активнос 5 163108ти в течение 20-30 сут, Для использования в данном способе дрожжевыеклетки не требуют какой-либо предварительной обработки. Биомассу дрожжейполучают культивированием штамма5Р.8 ц 1111 еппопй 11 ВКПИ Ув 500 млколбах на качалке (200 об/мин) всреде, содержащей, г; сахароза 20,(БН+) 80+ 3; КНРО 0,5; МВВО 0,2,дрожжевой экстракт 0,5, вода водопроводная до 1 л, Клетки из ранней стационарной фазы роста отделяют от среды центрифугированием и промываютдистиллированной водой, Полученнуюбиомассу используют для определенияактивности рибофлавинкиназы сразу,либо сохраняют до использования вовлажной камере в охлажденном состоянии при 0-4 С. 20Способ иллюстрируется следующимипримерами:П р и м е р 1. К исследуемойпробе объемом 0,5 мл, содержащейрибофлавинкиназу, прибавляют 0,5 мл 25реакционной смеси, содержащей6 х 10 М рибофланин, 6 х 10 М АТФ,2 х 10М МАМБО,1,0,04 М 14 а-фосфатныйбуфер рН 7,0 и пробу инкубируют при37 С в.течение 30 мин. После инкубации пробу сразу же помещают в кипящую воду,. на 5 мин и затем охлаждают,К пробеприбавляют 0,1 мл 0,5 М раствора КН РО и 0,1 мл водной суспензиидрожжей штамма Р. дц 111 ьегшопаЫ ВКЙУ, содержащей 100 мг клеток (сухой вес) 1 мл. Пробу инкубируют с перемешиванием при 30 С в течение 30 мини. центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин,Затем 0,5 мл полученной надосадочнойжидкости помещают в Флуорометрическую кювету, доводят объем дистиллированной водой до 8 мл,и измеряют флуоресценцию раствора на электрофлуориметре ЗФ-ЗМ, Активность рибофлавинкиназы в исследуемой пробе рассчитывают до Формуле:Активность рибофлавинкиназы =-6К = 8,5 х 10 , если цена деленияшкалы флуориметра установленаравной 0,01 мкг флавина.1Например, показание флуориметра при определении активности рибофлавинкиназы в пробе равно 55 единиц флуоресценции, Тогда активность рибофлавинкиназы в исследуемой пробе составляет; 55 х 8,5 х 10 = 46,75 х 10 Е,ЮП р и м е р 2. Определение активности рибофлавинкиназы аналоги- но описанному в примере 1 за исключением состава реакционной смеси, содержащей 5 х 10 И рибофпавин, 5 х 10 М АТФ, 1 х 10 М МАЗО ,и 0,04 М Иа- фосфатный буфер рН 80. Количественно определение активности рибофлавинкиназы в исследуемой пробе аналогично описанному в примере 1.формула изобр ет енияСпособ определения активности рибофлавинкиназы, предусматривающий инкубацию исследуемой пробы, содержащей Фермент, рибофлавин, аденозин-+5 -трифосфат и ионы МВ , отделение субстрата - рибофлавина от продукта Ферментативной реакции Флавинмононуклеотида и измерение количества последнего в пробе, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и удешевления способа, по окончании инкубации в реакционную смесь добавляют штамм дрожжей РсЬа 8 ць 1- 1 дегшопйд 1 ВКПИ У, содержащий специфичную к рибофлавину транспортную систему рибофлавинпермеазу, а отделение рибофлавина осуществляют посредством транспорта рибофлавина в клетки дрожжей.1631089 Исследуемая проба Активность рибофлавинкиназы, Е(мг белка х 10 , определенная по способу Предлагаемый Известный 4,319,0 4,219,0 37,3 43,6 37,1 43,8 17,8 17,8 36,8 36,4 28,0 27,9 226,9 228,4 Б Э) 2 Фбффиаанкаввэц в прабв,В к 10г Составитель А. СеменовРедактор М. Недолуженко Техред Л.Сердюковаорректор И, Муска 524 Тираж 363 Государственного комитета по изо 113035, Москва, Ж, Р Зака ВНИИПИ Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужг ул. Гагарина,101 Бесклеточные экстракты,Вгеч 1 ЬасСегыщ К 1 ачцвАТСС 13032Вас 11 цз вцЬ 11 ха ВЬЮНапзепц 1 а ро 1 ущогрЬаВНИИ Генетика М 1, 8СапдЫа ЬоЫ 1 п 11 ВСБ РсМа ВЫ 111 егтпопйЫАТСС 9058Очищенные препаратыферментаОсажденный (БН)80(0,4-0,9 ед. насыщения)Осажденный этиловымспиртом (50-807)фракционированный насефадексе Гподписноеретениям и открытиям при ГКНТ Сушская наб д. 4/5