Способ определения фосфорорганических нестицидов в воде

. Ф К РСКОМ ВИДЕТЕЛЬСТВ 3987188/302.12.8515,12.87ИнститутСССР Бюл. Риологии Чуйко,ова микроколитах питания, олос, 1983,СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССС ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ САНИЕ ИЗОБ(71) б внутренних вод АН(56) Методы определениячеств пестицидов в продук кормах и внешней среде. К с. 57-62.Аугустинссон К.Б,Распределение и определение холинэстераз в организме млекопитающих, Бюллетень ВОЗ, 1972, т, 44, Р 1-2-3, с. 104-114, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ фОСФОРОРГАНИ- ЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ В ВОДЕ(57) Изобретение относится к методам биологического анализа вод. Целью изобретения является повышение чувствительности и расширение функциональ ных возможностей за счет определения метаболитов фосфорорганических пестицидов. Анализируемую пробу водыили забуферивают 0,1 М фосфатнымбуфером и фильтруют (при высоких концентрациях пестицидов) или токсикантэкстрагируют из воды хлороформомхлороформ испаряют, экстракт растворяют в 0,1 М фосфатном буфере (принизких концентрациях пестицидов),в подготовленную пробу вносят ферментнаиболее чувствительный к определяемому токсиканту (ацетилхолинэстеразаэритроцитов человека, холинэстераза,крови человека, пропионилхолинэстераза, холинэстераза сыворотки кровисинца или плотвы, холинэстераза гомогената дафнии), пробы дважды инкубируют при 30 С. определяют остаточную активность Фермента и по калибровочным графикам, выражающимзависимость между концентрацией пестицида и угнетением активности Фермента линейной Функцией, рассчитывают содержание токсиканта в анализируемой пробе. 2 з.п. Ф-лы, 1 табл.1 13597Изобретение относится к способамбиологического анализа качества воды, а именно к анализу природных источных вод на содержание в нихфосфорорганических пестицидов и ихбиологически активных метаболитов поацетилхолинэстеразной активности, иможет быть использовано также в токсикологических исследованиях для 10контроля стабильности исследуемыхрастворов и в скрининге (первичнойпроверке токсичности) вновь синтезированных химических соединений,Целью изобретения является повышение чувствительности и расширениефункциональных возмо.юностей за счетопределения метаболитов фосфорооргаческих пестицидов.Дпя этого анализируемую пробу 20воды или забуферивают 0,1 М фосфатнымбуфером рН 7,5 и фильтруют (при определении высоких концентраций пестицидов в случае гибели в водоемерыбы и в лабораторных токсикопогических опытах) или подвергают дважды экстрагированию хлороформом (приопределении низких концентраций,фоновые уровни загрязнения), затемхлороформ выпаривают, а экстракт раст воряют в 0,1 М фосфатном буфере, Подготовленную первым или вторым способом пробу для анализа вносят в 3 пробирки по 2,5 мп в каждую, а в 3 другие пробирки вносят такое же количество 0,1 М Фосфатного буфера (контроль). Затем во все пробирки добавляют по 0,5 мя раствора фермента - наиболее чувствительного к определяемому токсиканту, т.е, ингибируемогоболее низкой концентрацией (таблица),В таблице приведена концентрация пестицида (мг/л), снижающая активность Фермента на 10-й предел определения фосфорорганических пестицидов в воде энзиматическим способом,В 3-ю и 6-ю пробирки (пробирки сравнения, необходимые для определения степени окрашенности используемах растворов и исключения неферментативного гидролиза субстрата) кроме того вносят 2 капли 0,052-ного раствора прозерина для ингибирования фермента. Пробирки встряхивают и поме щают в водяную баню на 30 мин,чтобы обеспечить оптимальное взаимодействие фермента с токсикантом, и выдерживают там при 30 С, что ближе к 412стандартным условиям протекания биохимических реакций. После инкубации в каждую пробирку приливают. 0,5 мл смеси 0,001 М ДТНБ (5,5-дитио-бис- (2-нитробензойная кислота) и 0,00 б М субстрата (при использовании фермента ацетилхолинэстеразы - ацетилтиохолин" Йодид или ацетилтиохолинбромид пропионилхолинэстеразы - пропионилтиохолинйодид или пропионилтиахолинбромид, холинэстеразы - бутирилтиохолинйодид или бутирилтиохолинбромид) в соотношении 1:1. Смесь добавляют для образования окрашенного комплекса, появляющегося при взаимодействии субстрата с ферментом, Затем инкубируют повторно 10 мин, чтобы фермент провзаимодействовал с субстратом, и добавляют в 1,2,4,5-ю пробирки по 2 капли 0,05 Е-ного раствора прозерина для остановки реакции, и определяют активность Фермента методом Эллмана, .в основе которого лежит измерение продукта реакции, а не непро" реагировавшей части субстрата, как в методе Хестрина, что и обеспечивает более высокую точность предлагаемого способа, Степень окрашивания растворов в пробирках 1 и 2 измеряют относительно пробирки 3, в пробирках 4 и 5 относительно пробирки 6 пробирки на ФЭКе с зеленым светофильтром, Высчитывают среднее значение исследуемых (1-ой и 2-ой пробирок) и конт. рольных (4-ой и 5-ой пробирок) проб и по формуле определяют степень угнетения активности ферментаЕ 100 А = 100 - - ---Е к где А - степень угнетения активности фермента;Е - экстинкция исследуемой проопбыЕ - экстинкция контрольнойпробы,Процент угнетения активности фер-,мента переводят в пробит по таблицеизвестным способом. Далее рассчитывают содержание в пробе пестицида покалибровочному графику. В отличиеот прототипа на графике по оси ординат откладывают не проценты угнетенияактивности Фермента, а пробиты процентов, а по оси абсцисс - не концентрации токсиканта, а логарифмыконцентраций, что позволяет представить зависимость между концентрация з 13597ми токсиканта и угнетением активности Фермента линейной функцией, Прирасчете, количества пестицида в исследуемой пробе па пробиту процента угнетения активности фермента находят5логарифм концентрации пестицида, апо таблицам антилогарифмов - концент"рацию пестицида в мкг/л или мг/л исследуемой воды, 1 ОП р и м е р, 1 л воды, отобраннойв канале ирригационной системы натерритории совхоза проводящего обработку садов фозаланом, наливают вемкость, добавляют 25 мп хлоРоФоРма,пробу перемешивают 10 мин в рукахили 5 мин на магнитной мешалке, затемпереносят в делительную воронку. После отстаивания хлороформную Фракцию сливают в сосуд для выпариваниячерез воронку с фильтравальной бумагой и слоем безводного сернакислаганатрия. Операцию экстракции повторяютдважды, Экстракт досуха выпаривают наводяной бане при 70 С или в колбе ротационнаго испарителя типа ЭРА-СМ ирастворяют в 10 мп Фасфатнаго буфера.В три пробирки вносят по 25 мл исследуемой пробы и в три пробирки по2,5 мп 0,1 И фосфатнаго буфера (контроль), Ва все пробирки добавляют по0,5 мл раствора холинэстеразы сыворотки крови человека, разведенной0,1 М фосфатным буфером до активности по прибору 0,650, что соатветству- З35ет 0,92 мкмоль/ч гидролизуемого субст.рата или 0,015 Е, за 10 мин инкуба"ции, а в 3-ю и 6-ю пробирки крометого по 2 капли 0,05%-ного растворапрозерина. Пробирки встряхивают.и 4 Опомещают на 30 мин в водяную баню стемпературой 30"С, После инкубациив каждую пробирку вносят 0,5 мп смеси 0,001 М ДТНБ и 0,006 М субстрата,бутирилтиохолинбромид или бутирилтиохолинйодид) в соотношении 1:1Пробирки встряхивают и снова инкубируют в водяной бане при 30 С, После10-минутнай инкубации в пробирки1,2,4,5 добавляют па 2 капли 0,05%ного раствора празерина и затем измеряют степень окрашенности растворов в 1-ой и 2-ай пробирках относительно 3-ей пробирки и в пробирках4 и 5 относительно пробирки 6 на фЭКес зеленым светофильтром,Результаты по пробиркам следующие:1 0,2202 0,2364144 0,6475 0,653Складывают результаты измерений пробирок 1 и 2, пробирок 4 и 5, высчитывают среднее значение и па формуле определяют степень угнетения активности Фермента в %Е ад 100 Ек где Е- экстинкция исследуемой пробы (0,220+0,236):2=0,228;Ек - экстинкция контрольнойпробы (0,647+0,653):2=0,650А - степень угнетения активности фермента равна 65%,Процент угнетения активности фермента переводят в пробит - 65% соответствует,пробит 5,39, Па предварительно построенному калибровочному граФику, используя пробитгнетеня активности Фермента, находят логариФм концентрации фазалана, рав ый 2,4, а по таблицам антилагарифмав - концентрацию пестицида в анализируемой воде, которая составляет 0,004 мг/л.Приведенный пример осуществления способа используется прн проведении фоновых наблюдений за водой, т.е. тогда, когда в ваде присутствуют малые концентрации пестицидовПри наличии больших концентраций пестицидов в воде используется упрощенный вариант способа.П р и м е р, Берут 100 мп ан"-пизируемой воды, забуферивают до рН 7,5, добавляя 1,22 г Иа НРО+н 0,193 г ЖН РО ф рН контролируют рН метрам или ионамерам. Пробу Фильтруют через воронку с фильтравальнай бумагой. В три пробирки вносят па 2,5 мп подготовленной пробы и в три пробирки по 2,5 мп 0,1 М фасфатнага буфера. Во все пробирки добавляют па 0,5 мл сыворотки крови синца, разведенной 0,1 М фосфатным буферам 1:20 да активности по прибору 0,650, а в 3-ю и 6-ю пробирки кроме того па две капли 0,05%-нага раствора празерина. Пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в водяную баню с температу 0рай 30 С, После инкубации в каждую пробирку вносят 0,5 мл смеси 0,001 М ДТНБ и 0,006 М субстрата бутирилтиохолинбрамид или бутирилтиахалинйадид в соотношении 1:1, Прсбирки встряиФ вают и снова инкубируют в водяной баЗО 40 45 50 пробиркам следующие: 0,7200,7400,0600064 Результаты по 1245 5 13597не при 30 С, После 10 мин инкубациив пробирки 1,2,4 и 5 добавляют по2 капли 0,05%-ного раствора прозерина и затем измеряют степень окрашенности растворов в пробирках 1 и 25относительно пробирки 3 и в пробирках 4 и 5 относительно пробирки 6 наФЭКе при зеленом сфетофильтре,Результаты по пробиркам следующие: 101 0,4402 0,456. 3 0,6205 0,624Складывают результаты измеренийпробирок 1 и 2, и пробирок 4 и 5,высчитывают среднее значение, и поформулеопределяют степень угнетенияактивности Фермента в % где Е, - экстинкцня исследуемойпробы (0,440+0,456)22ОЭВ 9Е - экстинкция контрольнойпробы (0,620+0,624) :2=0,622;А - степень угнетения активности Фермента равна 28%,Процент угнетении активности Фермента переводят в пробит - 28% соответствует пробиту 4,4. По предварительно построенному калибровочному графику, используя пробит угнетения активности Фермента, находят логарифм концентрации Фосфамида равный О, а по таблицам антилогарнфмов - концентрацию пестицидов в анализируемой воде, которая равна 1 мг/лПри определении метаболитов, например метаболитов хлорофоса, в токсикологическом опыте при изучении поведения водяного ослика в растворах хлорофоса берут в начале опыта 10 мл анализируемой воды, забуферивают до рИ 7,5, добавляя 0,122 г ИаНРО и 0,0193 г ЮаНРО 4 рИ контролируют рН-метром кли иойомером. Пробу Фильтруют через воронку с Фильтровал ной бумагой, В три пробирки вносят по 2,5 мл О,1 М Фосфатного буфера, Во все пробирки добавляют по 0,5 мл сыворотки крови синца, разведенной 0,1 М Фосфатным буфером 1:20, до активности по прибору 0,750 а в 3-ю и 6-ю пробирки, кроме того по две капли 0,05%гного раствора прозерина. Пробирки встряхивают и помещают на 41 630 мин в водяную баню с температурой30 С, После 1 О мин инкубации в пробирки 1,2,4 и 5 добавляют по 2 кап-,ли 0,05%-ного раствора прозеринаи затем измеряют степень окрашенности растворов в пробирках 1 и 2 относительно пробирки 3 и в пробирках 4и 5 относительно пробирки 6,Результаты по пробиркам следующие:1 0,7252 0,7350,2405 0,252Складывают результаты измеренийпробирок 1 и 2, и пробирок 4 и 5,высчитывают среднее значение и поФормуле определяют степень угнетенияактивности Ферментов в % где Е - зкстинкция исследуемойОппробы (0,725+0,735): 2 == 0,246;А - степень угнетения активности Фермента равна 66%,Через 4 ч согласно схемы токсикологического опыта) опять берут 10 мл анализируемой воды, добавляют 0,122 г Юа НРО и доводят рН пробы до 7,5 ИаН РО, рй контролируют рН-метром или иономером, Пробу фильтруют через воронку с Фильтровальной бумагой,В три пробирки вносят по 2,5 мл подготовленной пробы и в три пробирки по 2,5 мл 0,1 М Фосфатного буфера, Во все пробирки добавляют но 0,5 мл сыворотки крови синца, разведенной 0,1 М фосфатным буфером 1:20 до ак" тивности по прибору 0,750, а в третью и шестую пробирки, кроме того по две капли 0,05%-ного раствора прозе- рина. Пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в водяную баню с температурой 30 С. После 1 О мин иикубации измеряют степень окрашенности растворов в пробирках 1 и 2 относительно пробирки 3 и в пробирках 4 и 5 относительно пробирки 6.А роф ез эк акции 0,01 0006,012 ракци Ма без экстракции 0,01,69 ст 0,0002 0;0060 ракци 7 13597Складывают результаты измерений пробирок 1 и 2 и пробирок 4 и 5, высчитывают среднее значение, и по фор" муле определяют степень угнетения ак 5 тивности фермента в % где Е, - экстинкция исследуемой 10пробы (0,720+0,740): 2 == 0,730;Е вэкстинкция контрольной.кпробы (0,060+0,064); 2 =0,062; 15- степень угнетения активности фермента равна 85%.Увеличение антихолинэстеразной активности раствора хлорофоса с 66 до 85% свидетельствует о повышении его 20 токсичности за счет превращения хлорофоса в токсичные метаболиты,формула изобретения 1. Способ определения фосфороргани ческих пестицидов в воде, включакпций отбор пробы, введение в нее холинэстеразы и субстрата, инкубированиес последующим колориметрированиемо т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения чувствительностии расширения функциональных возможностей за счет определения метаболитов фосфорорганических пестицидов,перед введением фермента пробу забуферивают до рН 7,5, в полученныйраствор вводят холинэстеразу, послечего полученную смесь инкубируют, вкачестве субстрата используют бутирилтиохолинбромид или бутирилтиохилиниодид, который вводят после инкубации пробы с холинэстеразой. 2, Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что перед забуфериванием пестициды экстрагируют хлороформом.3. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что после забуферивания из исследуемой пробы удаляют образовавшийся осадок.1 О 1359741 Продолжение таблицы Фозалон 0,02 0,04 0,05 0,76 при экстракции 0,002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0076 Фосфамид беэ экст"ракции 19,05 19,05 19,05 0,19 при экстРакции 0,2 0,2 0,2 о,оог Корректор О,Кравцова Редактор Т,Парфенова Заказ 6151/48 Производственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул.Проектная,4 без экстракции 0,2 Составитель Н,КостюнинаТехред Л.Сердюкова,т Тираж 776 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д.4/5