Способ получения рестриктазы с i

разца отсоединяется от колонки ДЗАЭ- сефацел.Используемый штамм Сац 1 оЬасег ХцяИогпйя ВСполучен из музея куль 5 тур Института биохимии и Физиологиимикроорганизмов АН СССР и хранится в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика под коллекционным номером ВКПМ В.10Сац 1 оЬасгег ЕцяЫогвя ВСобладает морфологическими, культуральными и физиологическими признаками, харак- терными для всего рода Сац 1 оЪасег: грамотрицательные, аэробы, низкомеэофильные хемогетеротрофы. В культуре Сац 1 оЬассег ГцяНогвхя ВСприсутствуют клетки трех морфологически различных типов: жгутиковые, стебельковые и предделящиеся. Продолжительность клеточного цикла не зависит от условий питания. Оптимальная температура роста 30 ОС. Культура хранится в. пробирках, содержащих 503 питательной среды, на которой проводилось культи вирование, и 503 глицерина при -20 С в течение 2 лет.Отличительным признаком предлагаемого способа получения рестриктазы СЕц 1 является использование на первой ЗО стадии очистки фосфоцеллюлозы с элюцией градиентом натрия хлористого 0,1-1,0 И, что обеспечивает отделение Иц 1 от основной массы белков, нуклеиновых кислот, рестриктазы Сйц 11, ДНК-метилтрансфераз.Другим существенным признаком является использование для очистки рестриктазы системы колонок ДЭАЭ-сефацел-гепарин-сефарозы с нанесением образца при концентрации натрия хлористого 0,08-0,1 И, что обеспечивает сорбцию неспецифических ДНК-нуклеаз и Фосфатазы на ДЭАЗ- сефацеле, а рест риктаэы СГц 1 на гепарин-сефарозе, с которой фермент элюируется градиентом натрия хлористого 0,3-1,0 М.Полученная рестриктаза СГц 1 характеризуется следующими свойствами.50Узнает и специфически расщепляет только метилированные последователь-. ности 5 СвфАфТС (место расщепления указано стрелкой).Оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-7,8.Оптимальная концентрация ЯаС 10-50 мм. Для проявления активности рестриктазы требуется М", оптимальнаяконцентрация 10-15 мм.П р и м е р , Получение рестриктазы СйцТ из Сац 1 оЬасег Гця 1 Гогв 1 яВС.Последовательность операций.следующая,Получение биомассы: поддерживаниепродуцента; выращивание посевногоматериала; культивирование штамма .Выделение и очистка рестриктазы:разрушение клеток; хроматография нафосфоцеллюлозе; хроматография на колонках ДЭАЗ-сефацел-гепарин-сефароэы,Для культивирования штамма и получения биомассы Сац 1 оЬасег Гця 1 йогв 1 я ВСиспользуют, следующую аппаратуру: качалку 8-25 Меч Вгцпяю 1 с 1",спектрофотометр СФ, бокс ламинарный, центрифугу "Весйпап 12-21".Штамм Сац 1 оЪасег ГцяИогв 1 я ВСподдерживают в пробирках на питательной среде, содержащей, г/л пептон,0-2,2; дрожжевой экстракт 1,0-1,2;МАЗО 7 НО 0,2-0, 22 и 504 глицеринапри -20 С, Для оживления культурупересевают в чашки Петри, содержащиесреду следующего состава, г/л: пептон2-2,2, дрожжевой экстракт 1,0-1,2,МАЗО 7 НО 0,2"0,22; агар 15-20, рН68-7,0, и инкубируют в течение 4 сутпри 28-3 0 С, Кул ьтуру, Сац 1 оЬас е ег Гц я х 2 огпая ВСпересевают в колбы Зр-)ленмейера с 200-250 мл питательнойсреды, содержащей, г/л: пептон 2,02,2; дрожжевой экстракт 1,0-1,2; МБ(7 НО 0,2-0,22 при рН 6,8-7,0. Клеткивыращивают в термостатированной качалке при 250 об/мин, 28-30 С в течение 4 сут до оптической плотностисдОТр, равной 1,9-2,1 опт. ед.Затем клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием.оПолученную биомассу хранят при -20 С.Выход сырой биомассы составляет 1,72,2 г/л питательной среды,Для выделения и очистки рестриктазы используют следующую аппаратуру:ультразвуковой деэинтегратор УЗДН,центриФугу "Вес 1 цпап 12-21", холодильный шкаф. "Ипь. Со 1 Й ТаЪ", хроматографические колонки, термостат, аппарат для электрофореза, источник питания УИП, ультрафиолетовый осветитель.ДНК рВВ 322 выделена по известнойметодике.ФФормула и з о б р е т е н и яСпссоб получения рестриктазы СГц 1, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизмаСаы 1 оЬасгег ГцзЫогппз ВКПМ Вна пи" тательной среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт, воду и сульфат магния, с последующим разрушением клеток ультразвуком и очисткой Фермента путем хроматографии, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса очистки и повышения выхода целевого продукта, хроматографию ведут на колонке фосфоцеллюлозы с элюцией градиентом хлористого натрия от 0,1 до 1,0 М и затем на системе колонок ДЭАЭ-сефацел-гепарин-сефарозы с нанесением образца при концентрации 5 15464При разрушении клеток и хроматографии используют буферный растворА: 0,01 М калий-фосфатный буфер,рН 7,4, содержащий 0,005 М 2-меркаптоэтанола, 0,001 М трилона В.Активность рестриктазы тестируютметодом гидролиза ДНК рВК 322 с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом агарозным гелем: 0реакционная смесь для гидролиза содержит 0,01 М трис-НС 1 буфер, рН 7,5 рсодержащих 0,01 М МИС 1, 0,001 М дитиотрейтола, 2 мкг рВК 322 и 1-5 мклфермента в 40 мкл смеси. Реакцию проводят при 37 С в течение 1 ч.Электрофорез проводят в 0,1 М натрий-боратном буфере, рН 8,2, 0,002 мЭДТА в течение 1 ц при напряжении100 В. Окрашенные этидий бромидом 20(1 мкг/мл) гели просматривают в Уфсвете.За условную единицу активностипринимается то количество фермента,которое при 37 С в течение.1 ч дает 25специфическое фрагментирование субстрата, не изменяющееся при добавлении больших количеств рестриктазы.Все операции по выделению и очистоке фермента проводят при 430Разрушение клеток, 30 г биомассы,полученной при культивировании Сац 1 оЪасег ГцзИогщдя ВС, суспендируютв 60 мл буфера А, содержащего 0,1 МИаС 1, обрабатывают ультразвуком надезинтеграторе мощностью 300 Вт втечение 10 мин и центрифугируют при20000 об/мин на центрифуге БекманЖ, ротор ЖА"20,Хроматография на Фосфоцеллюлозе 40Полученный бесклеточный экстракт соскоростью 30 мл/ч наносят на колонку(2,5 х 15 см) с фосфоцеллюлозой, уравновешенной буфером А, содержащим0,1 И ИаС 1. Колонку промывают 60 мл 45этого же буфера и Фермент элюируютградиентом ИаС 1 от О, до 1 М. Фракции, содержащие рестриктазную активность, элюируемые при 0,54-0,56 МКаС 1, объединяют. 50Хроматография на ДЭАЭ-сефацелгепарин-свфарозе. Ферментный препарат, полученный на предыдущей стадии,разводят буфером А до концентрацииЯаС 1 0,1 И и со скоростью 70 мл/чнаносят на систему колонок, состоящую из колонки ДЭАЗ-сефацел (1,5 хх 8 см), соединенной последовательнос колонкой гепарин-сефарозы (1,5 х 856х 8 см). После нанесения образца колонки промывают 50 мл буфера А. Колонку с ДЭАЭ-сефацелем отсоединяют. Через колонку гепарин-сефарозы пропускают 20 мл буфера А, содержащего 0,3 М МаС 1, и фермент элюируют градиентом 0,3-1 М фракции, содержащие рестриктазвую активность, элюируемые при 0,53-0,55 М ИаС 1, объединяют и концентрируют против 0,01 М калийфосфатного буфера, рН 7,4, 0,1 И ЮаС 1, 0,001 М дитиотрейтол, 0,001 М ЭДТА, 503 глицерина (по объему) и хранят при -20 С, Из 1 г биомассы получают 1000 единиц рестриктазы.Предлагаемый способ обеспечивает получение высокоочищенного Фермента, ,соответствующего требованиям, предъяв. ляемым к коммерческим препаратам рес" триктаз.Преимуществом изобретения чо сравнению с известным является его. быстро- та и высокий выход фермента . Это достигается исключением всех стадий диализа и осаждения белка сульфатом аммония, а также использованием системы колонок ДЭАЭ-сефацел-гепаринсефароза, которая позволяет получить очистку фермента на обоих сорбентах в одной стадии с максимальной скоростью и осуществить очистку рестриктазы Сйы 1 за два дня . Продолжительность очистки фермента по известному способу составляет не менее 6 дней, Сокращение до минимума числа операций и продолжительности выделения фермента позволяет повысить выход фермента от 50-60 до 000 ед/г биомассы Сац 1 оЬасег йцзЫоппз ВС.1546485вхлористого натрия от 0,08 до 0,1 М енте хлористого натрия от 0,3 до . и элюции с гепарин-сефарозы в гради,0 М,Составитель И, Привалова Корректор О. Ципле Редактор Н. Киштулинец Техред А.Кравчук Подписное Тираж М 7 Заказ 56 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, ЖРаушская наб д. 4/5