Способ получения люциферазы светляков luciola мingrеliса

союз советскихСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5 С 12 И ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ь). ПоцифераэымВ/мг.(56) филлипова Н.й. Лухович А.Ф., Букатина В.А Угарова Н.Н. Аллостерический механизм регуляции активности люциферазы светляков Ьцс 1 о 1 а ш 1 пвге 11 са. - Биохимия, 1984, т. 49,вып. 12, с. 1965-19.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛОЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ Ь 1 С 10 ЬА М 1 ЖКЕЬ 1 СА (57) Изобретение относится к биохимии, а именно к способу получения гомогенного препарата люцифераэы свет ляков Ьис 1 о 1 а в 1 пге 1 зса и может Изобретение относится к биохимии, а именно к способу получения гомогенного препарата люциферазы светляков Ьцсхо 1 а шЫрге 11 са.Цель изобретения - обеспечение гомогенности и повышение удельной активности люциферазы и концентрации белка.Отличительной особенностью предлагаемого способа является проведение после ионообменной хроматографии аффинной хроматографии на полисахаридном носителе, модифицированном голубым триазиновым красителем, при соотношении белок:носитель 1:30-500, проведение элюирования люцифераэы буферным раствором, содержащим 1-15 ммоль АТФ или 1-5 ммоль люциферина.,ЯО 1546484 А 1 быть использовано в медицинском мйкроанализе, генной инженерии. Цельизобретения - обеспечение гомогенности и повышение удельной активностилюциферазы и концентрации белка. Способ включает получение экстрактасветляков гель-фильтрацию экстрактаили высаливание сульфатом аммония,анионообменную хроматографию, аффинную хроматографию на полисахаридномносителе, модифицированном 1-амино-хлор-сульфофенил)амино)-1,3,5-триазин-ил)амино)-3-сульфофенил)амино) -9,10-дигидро, 10-диоксо-антраценсульфоновой кислотой(голубой триаэиновый красителлучают гомогенный препарат люс удельной активностью 2 101 з,п. Ф-лы, 1 табл. П р и м е р 1, 2,5 г сухих лампочек светляков растирают в порошок в охлажденной ступке в смеси с 25 г карборунда и экстрагируют 25 мл 0,05 И трис-ацетатного буфера, рН 7,8, содержащего 2 мМ ЭЛТА 0,3 И БаС 1 в течение 4 ч при 4 С. Центрифугируют 30 мин (20000 об/мин 4 С) осадок отбрасывают, Полученныи экстракт наносят на колонку с сефадексом С(грубым), уравновешенным 0,05 И трис-ацетатным буфером, рН 7,8, содержащим 2 мМ ЭДТА, 10 мИ МАМБО,. Элюируют люциферазу тем же бу фером. Фракции, содержащие активную люциферазу, наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой, уравновешенной тем же буфером. Затем колонку промывают156 ч 81 1:60 1:50 АТФ АТФ 100 Голубая агароза Гомогенныйпрепарат, 1Гомогенныйпрепарат 5 АТФ АТФ АТФ АТФ АТц 2 10 2 10 0 50,51 1:30 1:30 5" 1 О 0,01 В, ,Гомогенный препарат,0 2 10 2 1 О 0 тем же буфером для удаления с носителя,несвяэавшихся веществ. Люцифераэу элюируют тем же буфером, но содержащим 60 мМ МАЗО,. Во Фракциях, содер-жащих люциферазу спектрофотометрическим методом определяют концентрациюбелка, и полученные фракции наносятна колонку с голубой агарозой в соотношении белок:носитель 1:30. Несвязав шиеся белки смывают 0,05 М трис-ацетатным буфером, рН 7,8,. содержащим2 мМ ЭДТА 60 мМ ИМБО. Злюцию люциферазы проводят тем же буфером, содержащим 15 мК АТФ. Получают раствор люцифераэы с концентрацией белка0,05 мг/мл и удельной активностью2 10 мВ/мг, Выход по активности сос 9тавляет 1004 от исходной.Раствор люциферазы после аффиннойхроматографии на голубой агарозе концентрируют в 10 раз ультрафильтрациейна фильтре Аписоп с использованиеммембраны УМ. При концентрированиисохраняется 100 активности. Получают 25раствор люцифераэы с концентрациейбелка 0,5 мг/мл. При диск-электрофореэе в йолиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препаратдает одну полосу, что свидетельствуето его гомогенности.Остальные примеры проводят аналогично примеру 1 с изменением носителя,соотношения белок:носитель и концентрации АТФ или люциферина,Результаты хроматографии люцифера- З 5зы на голубой агарозе и голубой сефа"розе при различных соотношениях белок:носитель и различных концентрацияхприведены в таблице. Таким образом, предлагаемый способ получения люциферазы обеспечивает получение препарата гомогенной люциферазы в концентрированном виде с удельной активностью 210 ф мВ/мг. Высокая активность и гомогенность препарата делает возможным его использование в биохимии медицинском микроанализе для определения ультрамалых количеств АТФ, в генной инженерии,Формула изобретения 1. Способ получения люциферазы светляков Ьцсо 1 а ш 1 пдге 1 са включающий получение экстракта светляков, очистку его от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией или высаливанием сульфатом аммония и фракционирование с помощью анионообменной хроматографии, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью обеспечения гомогенности и повышения удельной активности люциферазы, после анионообменной хроматографии проводят аффинную хроматографию на полисахаридном носителе, модифицированном 1.-амино-. -4-хлор-сульфофенил) амино)- -1,3,5-триазин-ил)амино)-3-сульфофенил)амино) -9, 1 О-дигидро, 10-диоксо-антраценсульфоновой кислотой при соотношении белок:носитель 1:30-500 и элюцию ведут буферным раствором, содержащим 1-15 ммоль аденозин-трифосфата или 1-5 ммоль люциферина.2. Способ по и.1 отличающ и й с я тем, что, с целью повышения концентрации белка, полученный препарат подвергают ультрафильтрации.т ю6Продолжение таблицы 154 Ийй 2 1 О-з0,01 2 10 ь2 "10 1:30 1:30 Люциферин 0,5Люциферин 1 Люциферин 2,5 1:30 0,03 Голубая агароза 0,.01 1:500 Люциферин 2,5 Голубаясефароза 1:30 АТФ 15 Составитель О,СкородумоваТехред А.Кравчук Корректор О.Ципле 1Редактор Н.Киштулинец Заказ 56 Тираж 4 РО ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и Открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раущская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101 1:100 Люциферин 2, 51:30 Люциферин 51;30 Люциферин 7,5 0,03 0,05 0,05 с 0,05 2 10 2 ".10 2 10 ф 21 Оз 2 1 О.Гомогенныйпрепарат