Способ генотипирования реассортантов вируса гриппа

-исследоватеВсесоюзныйий институтНаучно-произия "Вектор"Б.Голубев,в а 1 Я РЕАССОР ниями 2 таб ле ситс тел про тан ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Всесоюзный научноский институт гриппа инаучно-исследовательскмолекулярной биологииводственного объедине(54) СПОСОБ ГЕНОТИПИРТАНТОВ ВИРУСА ГРИППА(57) Изобретение отно Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к молекулярной вирусологии, и может быть использовано для типирования вирусов гриппа.Целью изобретения является увеличение чувствительности способа типирования реассортантов вируса гриппа.Увеличение чувствительности достигается тем, что на фильтрах иммобилиэуют вирусный лизат, в гибридизационную систему вносят дополнительно конкурирующую РНК из эталонных штаммов, тестирование результатов проводят с помощью денситометрирования, и типирование проводят на основе сравнения полученных данных со значениями для внутренних стандартов.П р и м е р 1. Определение родиьской принадлежности гена нуклеотеина МР у лабораторных реассортов. лярной вирусологии и может быть иси ол ь зова но для тип и рова ния вирусов гриппа. Целью изобретения является увеличение чувствительности способа типирования реассортантов, вируса гриппа, Увеличение чувствительности достигается тем, что на фильтрах иммобилизуют вирусный лизат, в гибридизационную систему вносят дополнительную конкурирующую РНК из эталонных штаммов, тестирование результатов проводят с помощью денситометрирования, а типирование проводят на основе сравнения полученных данных со значедля внутренних стандартов. Изучают две группы лабораторныхреассортантов с их родителями: роди- ,Ртельские вирусы А/Ленинград/9/46еций/1/68 (НЗИ 2) и А/Киев/59/79/Е(Н 1 Ю),на основе которого получают молекулярные зонды.Вирусы накапливают в аллантоисиой Эфполости 10-дневных куриных эмбрионов.4,5 мл аллантоисной жидкости с вирионами осветляют центрифугированием втечение 30 мин при 10000 об/мин(12000 В), после чего вирус осаждаютна дно центрифугированием в том жероторе 30 мин при 40000 об/мин (200000 В) . Жидкость сливают и к вирусной бляшке приливают 45 мкл буфера: 40 мМ трис-НС 1 рН 7,3, содержащего 250 мкг/мл протеинаэы К. Суспензию помещают в термостат при 37 С время от времени пипетируя. Через 2 ч добавляют равный объем 0,54-ного раствора додецилсульфата лития и оставляют при 37 С. Через 30 мин"пробирки с лизированными вирионами помещают в ледяную баню, По шаблону на 96 ячеек иэ каждой пробирки наносят в 2 точки по 2 мкл лизата на 8 пред- обработанных фильтра. Предобработанные фильтры получают следующим образом: из нитроцеллюлоэных фильтров вырезают прямоугольники размером 77 х 117 мм, смачивают дистиллированной водой, которую затем замещают 20 х ЯБС, после чего Фильтры высушивают на воздухеДля удобства на всех фильтрах схема нанесения препаратов идентична . Две ячейки используют для определения уровня фона и на них вРНК не наносят.Для иммобилизации вРНК лизированных вирионов после нанесения всех препрепаратов фильтры отжигают 2 ч при ЗО80 С в вакууме, затем промывают в воде от солей придающих фильтрам высокую хрупность и высушивают на воздухе.В качестве молекулярного зонда используют ДНК плазмиды рВК 1-МР/2, несущей полноразмерную ДНК - копию генануклеопротеина (ИР) рекомбинантногоштамма А/Киев/59/79/Р (Н 1 Г 11) происходящего от эпидемического вирусаА/Киев/59/79/Н 1 Г 11) приобретенногопоследним в результате реассортациис природными эпидемическими вирусамисероподтипа НЗГ 2, тамм Е. со 1 ь.НВ 101, содержащий указанную плаэмиду, 45выращивает в О, 5 л 1-ной среды ВН 1до поздней логарифмической фазы, бактериальные клетки собирают центрифугированием при 3000 р, в течение10 мин, плаэмидную ДНК выделяют щелочным методом с дополнительной очисткой равновесным центрифугированиемв градиенте хлористого цезия с бромистым этидием при 200000 в и 20 Св течение 36 ч. Для работы отбираютнижнюю полосу иэ градиента с кольцевой ковалентно замкнутой плаэмиднойДНК, которую метят -Р в стандартнойреакции ник-трансляции, От непрореа 1 4 А 1 тф 2 А(о- АР, Н О, ИУ, Йю,н) + А(чф, р,ч) гиоова вших трифосфа тов освобождаютсяг ел ь-фил ь тра ци ей,Предгибридизацию мембран в течение 1-3 ч ведут в 2 мл буфера длягибридизации состава: 50-ный формамид, 6 х ББС, по 0,02 бычьего сывороточного альбумина, фиколла и поливмнилпирролидона.кРНК для конкурентной точечнойгибридизации выделяют из куриных эмбрионов, зараженных эталонными штаммами, стандартными Фенольно-детергентным методом. На один фильтр необходимо около 100 мкг конкурирующейРНК, которую осаждают центрифугированием из-под спиртового раствора в течение 1 О мин при 3000 в и высушиваютв вакууме к моменту получения зф Р-меченого молекулярного зонда. К тремпробиркам, содержащим по 100 мкг высушенных осадков вРНК одного из эталонных штаммов: А/Хабаровск/74/77(Н 1 Г), А/Сингапур/1/57 Н 2 Г 2) илиА/РК/8/34 (НОГ 1)добавляют по 80 мклФормамида и по 20 мкл водного раствора Р-ДНК плаэмиды рВР 1-ГР/2. Прозгбирки прогревают на кипящей водянойбане в течение 1,5 мин, добавляютпо 2 мл гибридизационного буфера,полученный раствор вливают в полиэтиленовые мешочки с фильтрами в гибридизационном буфере и помещают в термастат на 42 С, Через 16-20 ч мембраны дважды отмывают раствором 2 х ЯБСпри комнатной температуре и дваждыпромывочным раствором (01 В ЯРЯ;01 х ЯБС) при 55-60 С. После высушивания проводят авторадиографию срентгеновской пленкой. Каждую проявленную пленку дважды сканируют при450 нм на денситометре, представляющем значения оптической плотностидля каждой точки,Для обсчета полученных данных проводят усреднения и вычитают фон радиоавтографа, Тогда средняя оптическая плотность Ар ) , пропорциональная количеству прогибридиэованного зонда ВР с РНК вируса при наличиив гибридиэационном буфере конкурирующей кРНК одного из эталонных вирусов Н равна:где А 01 5 154648А 2 - значения оптической плотности соответственно припервом и втором сканировании данного радиоавтограФа;У " индексы, соответственнопервого и второго нанесений лиэата вируса,МР - индекс гибридизации сплазмидой несущей ген,ИН - индекс гибридизации свведением конкурирующейкРНК одного из четырехэталонньх штдммов при 15нимает следующие значеяия: 0 - при внесениикРНК вируса А/РК/8/34(НОИ 1) 1 .- при внесениикРНК вируса А/Хабаровск/ 20/74/77 (Н 1 И 1) , 2 - привнесении кРНК вирусаА/Сингапур/1/57 (Н 2 И 2)3 - при внесении кРНКвируса А/Гонконг/1/68 25(Н 302);02 - индексы соответственно 6 бпервой и второй точекбез РНК.Условия гибридизации с равными фильтрами различны, посксльку зонд реагирует с разлицными кРНК с разной эффективностью в зависимости от отличий в их нуклеотидных последовательностях. Поскольку РНК ИР гена эталонного вируса Л/Киев/59/79/К имеет 1004 гомологию с клонированной последовательность Г)Р гена молекулярного зонда за точку отсчета принимают уровни гибридизации для указанного вируса. Для каждого вируса определяют велицину относительной денситометрической эффективности гибридизации (ОДЗГ):ОДЭГ (ф,) А(а.Як) 100,и(М, МР, Н) где К - индекс для вируса А/Киев/59/79 й.Для определения принадлежности 1)Р генов анализируемых штаммов для анализируемых штаммов, а также для эталонных штаммов вычисляют нормированные отношения денситометрических эффективностей гибридизации (НОДЭГ):.(ч, мр) ОДЭГ( + ОДЭГ() + ОДЗГ(ч мр, о)ОДЗГ(ч мр,) х 100ч ач 1ОДЗГ(ч, )Р,1) + ОДЗГ(ч нр ) ДЗ (ч мр о)ОДЗГ(,)р,)д х .100ОДЭ 1(чр,+ ОДЗГ(ч р, ) + ОДЗГ(чо)Сравнивают полученные значения лиз полученных результатов, о т л иНОДЭГ анализируемых штаммов со значе- ч а ю щ и й с я тем, цто, с цельюниями НОДЭГ эталонных или родитель- увеличения цувствител ьности способаских штаммов и относят изучаемый ви- на фильтрах иммобилизуют вирусный лич ч40рус к тои или инои группе методом на-зат в гибридизационную систему, содерименьших квадратов (см, табл. 1, 2). жащую плазмиду РВК 1-ИР/2 вносят дополнительную конкурирующую РНК иэФ о р м у л а и з о б р е т е н и я эталонных штаммов, тестирование реСпособ генотипирования реассортан- зультатов проводят с помощью денси,отов вируса гриппа, вклюцающий накоп метрии, на основании полученных зналение и концентрирование вируса, им- чений оптической плотности опредеграт мобилизацию РНК-содержащего материала параметры нормированной относительной на фильтрах, тоцечную гибридизацию денситометрической эффективности гиб" с дНК-зондами, авторадиотрафию и ана- ридизации НОдЭГ по формулам50А(ч, 5,)гдеАсреднее значение оптическойплотности;индекс использования в гибридизации молекулярного зонда 10с ДНК-копией сегмента Б;индекс анализируемого вируса,индекс вируса, сегмент кото"рого имеет максимальную средианализируемых вирусов гомоло гию с использованным в реакции зондом,Н - индекс гибридизации с введением конкурирующей РНК одного иэ эталонных штаммов,и с помощью метода наименьших квадратов производят отнесение тестируемого штамма к соответствующему эталонному . сероподтипу. Та бои ца 1Определение родительской принадлежности гена нуклеопротеина МРу лабораторных реассортантов Родитель Сероподтипопринадлежность (Н) НОЛЭГ,Штамм А/Ленинград/9/46 А/Ленинград/9/46 А/СССР/2/85А/Ленинград/9/46 А/Ленинград/134/17/57 Табли ца 2 Определение родительской принадлежности генов у лабораторных реассортантов с помощью конкурентной гибридизации Генф Вирус ет е еи иии 2 3 4 5 6 7 8РВ 2 РВ 1 РА НА ИР ЮА И ОЯ А/СССР/г/85 (НЗИг)А/Ленинград/9/46 (НОИ 1)М 18Ю 24Иф 25У 32 С С Л Л Л Л Л Л С С Л. Л С С С С С С Л Л Л Л Л Л Л С Л Л Л Л Л С Л С Л Л Л С С С Л Л Л С Л С,Л Л А/РК/8/34А/Хабаровск/74/77А/Сингапур/1/57А/Гонконг/1/68А/Ленинград/9/46А/СССР/2/85У 18У 24У 25Ю 32А/Ленинград/134/17/57А/Новошахтинск/3/868 3 52:37:11 18:26:56 38:11:51 34:33:33 61:30:09 38:37:2563:25:11 53:32:15 40;29"31 50:39:11 36:12:52 21:30:4935:12:53 0 1 2 3 0 3 0 0 3 0 2 1 2О 1546486 Продолжение табл,2 Вирус Ген" ВФ т 1 2 3 4 5 6 7 8РВ 2 РВ 1 РА НА БР МА И Ы ее же ееа ш /Ленинград/134/17/57(Н 2 И 2) Лд /Новошахтинск/3/86(Н 101) Н Лд Лд Лд Лд Лд Лд Лд Н Н Н Н Н Н Н Лд Лд Н Лд Н Лд Л ж ж та тфС - принадлежность сегмента штамму А/СССР/2/85(Н 3 И 2) Л - принадлежность сегмента штамму А/Ленинград/9/46 (НОВ 1) , Лд - принадлежность сегмента штамму А/Ленинград/134/3/57 (Н 202), Н - принадлежность сегмента штамму А/Новошахтинск/3/86 (Н 101). Составитель А.СпундэРедактор Т.Лазоренко Техред А.Кравчук Корректор.О.Ци Заказ 56 НИИРИ Госуда аж 494 одписн ретениям и открытиям при ГКНТ СССРушская наб., д. 4/5 е е а е е венного комитета по изо 113035, Москва, Ж, Р ЕЕЕ Е Етти Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул.Гагарина, 10