Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis, используемый для получения энтомопатогенных препаратов

(57) Изобретениенологии и касаетспатогенных бдктера именно нового1 ця сцггп 8 гепя 1 я я получения эцтомоиальцых препаратов, тамма бактерий Вдсг 1- для их производстэнтомопатогенныхпаратов, а именнорий для их получе цых п актериал нового ш ия Вас.с еаммд цггп Цель изобретенияо штамма бактерий создание ново Васг 11 ця сцггп 8обладающего ус наиболее часто я сасг Аагам ьтуру и сох пягя чаг. сц ойчивостью к ажающим ку производстнен няющего продук вестных штамых условиях тинность на уровнемов,зу сГГ я епягя ч но цопст) ОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 4334 Ь 78/3030,11,8723.12.89,Всесоюзныйпроектно-крикладнойЭ.Р. ЗурабНетыкса, ТДергалюк,Комарски576.8:632.Авторское787, кл. А Ъюл. М 47 аучно-исследонатель Изобретение относится к област технологии и касается получени бактерий Васг 11 ця сцгг сцгясасг получен обра 2на. Цель изобретения - создание ново го штамма бактерий Васг 11 ця сНцг 1 п 81 епягя чаг. сцгясасг, обладающего устойчивостью к Адгам, наиболее часто поражающим культчру н производственных условиях, и сохраняющего продуктивность на уровне известных штаммов Штамм бактерий Васг 11 ця сцг 1 пягепягя подвига сцгясасг полччен из штам ма В.сцггп 8 гепягя подвида сцгясасг Ев результате мутдгецной обработ ки нитрозогуанидином. Ему присвоен ) Е. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно в исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под коллекциоцным номером ВКПЧ В. Штамм це отличается от извес ного по продуктивности, токсичности для насекомых и Адгоустойчв к сагам1 ф 81 г 20 ТА 101, 1 табл,И-метил-нитро-нтрозогудидом в концентрации 50 мкг/мл при 37" С и последующей селекции на Аагоустойч- вость, в результате чего был выделен штамм Васг 11 ця с 1 тцггп 81 епягя чдг. сцг ясасг Е-ВЬ.Штамм депонирован во Всесоюзцс и коллекции промышленных микрооргаци - мон Всесоюзного научно-исследовательского института генетик и сенеки и промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКП-3827,Полученныи штамм харакедующими свойствам, Морфолого-культурдлььАэроб. Грамположителен. Вегетативные клетки - крупные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами или цепочками. 11 епочкикороткие. Размер клеток составляет(1,-1,9)х(3,5-6,9) мкм, Морфологической особенностью является наличиев одном спорангии двух белковых патогенных для насекомых параспоральных 1 Овключений - кристалл-токсинов ромбовидной и квадратной формы с четкимигранями,Указанная форма клеток характернадля любой твердой питательной среды:агар Хоттингера; МПА, пептоно-кукурузный агар. Штамм Вас,сЬиггп 8 епзгвчаг. Ецгзга 1 с 1 ЕЬ хорошо растет при28-37 С, оптимальная температура30 С.20Мяоопептонный бульон. Образуетсплошную пленку, гладкую, рыхлую,опадающую через 48-72 ч. Росс умеренный.Желточная среда. Образует колонии 25К-формы, крупные, плоские с шероховато-матовой поверхностью, маслянистой консистенции, белого цвета. Ростобильный, Лицетин белка не расщепляет.Ломтики картофеля. Образует колонии К-типа, крупные, плоские с шероховатой матовой поверхностью, маслянистой консистенции, Рост обильный.Пигмент не образует,Молочный агарОбразует колонииК-формы, крупные, с шероховатой ма 35товой поверхностью, маслянистой консистенции, Колонии белого цвета, вокруг которых об разуется;эона просветления до 20 мм, Рост обильный.Пептоно-кукурузный агар. Образуетколонии К-формы, крупные, плоские сшероховатой матовой поверхностью,маслянистой консистенции, с ветвистымкраем. Рост обильный,Кровяной агар. Образует колонииК-формы, крупные с ветвистым краем.Поверхность шероховатая, матовая, маслянистой консистенции, белого цвета.Вокруг колонии образуется светлаяпрозрачная зона гемолиза до 20 мм.Рост обильныйВозраст культуры приописании колоний на твердых средах24 ч.Физиолого-биохимические свойства.Дает положительную реакцию Фельгена, выделяет в культуральную жидкость протеазу, обладающую казеинолитической активностью 90 х 10 протеол. ед./мл, фибринолитической активностью800 усл.ед./мл, а гемолитической активностью (гемолиз типа /).Для определения гемолитической способности применяли мясопептонный агарс добавлением 51 дефибринированнойкрови, Гемолиз (лизис эритроцитов)узнавали по образованию светлой прозрачной эоны вокруг выросшей колонииили штриха. Гемолитическую активностьвыражали в миллиметрах радиуса зонпросветления.Фибринолитическую активность оценивали по величине зоны лизиса фибрина, образующейся при помещении фибриновой пластинки в термостат при температуре 37 О на 3 ч, и выражали вусловных единицах в пересчете на 1 илкультуральной жидкости. Одна условнаяединица равна зоне лизиса в 10 мм.В работе использованы фибриноген,фибринолизин и плазма крови.Каэеинолитическую активность определяли на молочном агаре.Не способен к образованию лецитиназы.Отношение к источникам углерода.Использует глюкозу, цитрат, декстрозу, эскулин, салицин, лобиоэу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку, кукурузный экстракт,Не использует лактоэу, арабинозу,рамноэу, глицерин, сахарозу, маннозу,маннит, ксилозу. Отношение к источникам азота, Усваивает нитратные и аммонийные формы азота.Органические источники азота, используемые данным микроорганизмом: пептоны (продукты псреваривания мяса и каэеина); мясные, рыбные и растительные экстракты (кукурузный, дрожжевой и др.) или настои; мука из семян хлопчатника, соевая, кукурузная, рыбокостная; атолизаты дрожжей и казеина; гидролизаты (из соевых бобов, кукурузной и осевой муки); кормовые дрожжи (ББК); кровь крупного рогатого скота; мясная вода; мочевина. Нитриты восстанавливаот молоко. 11 ептоницирует желатину, не разжижает крахмал, гилролиэует алтигенные свойства.Относится к 111 с,ротипу. (Н За Н Зв). Не продуцирует гермостабильный Б-экзотоксин. атогвввв для многихнасекомых отрядас.екрьвпи:, 1530159Не отличаясь по перечисленным свойствам от известного, пп амм характеризуется устойчивостью к ряду фа" гов, наиболее исто поражающих культуру в производственных условиях, которые имеют удлиненный капсид и структуру типа воротничка, расположенную между капсидом и коротким отростком. Подобные фаги выделены иэ фаголиэа тов. Эта группа фагов широко распространена и дает высокий относительный урожай (титр фага из одной негативной колонии) - до 9,0 х 10 фаговых частиц/мл, а также высокий абсолютный 15 урожай: при размножении на чувствительной культуре титр достигает 1,0 х х 10 фаговых частиц/мл (БОЕ/мл). Дляопределения устойчивости к фагам на чашку Петри с нижним слоем - средой О Хоттингера (2/), выливают 0,3 мл агариэованной (0,71) солевой среды и 0,1 мл испытуемой культуральной жидкости (3,5 ч б,Хоттингера). После того, как среда застынет, петлей нано сят препарат фага (концентрация фагане ниже 1 10 ), Наличие или отсутствие эоны лизиса свидетельствовало о чувствительности или устойчивости испытуемого варианта (штамма) к данно му фагу.Сравнительная характеристика штамма Бас,сЬцттпуепятя чаг. Ецтяса 1 ст Еи известного штамма Вас. с)штдпВтепяя чаг. Еытяса)т Еприведена в следующей таблице .Таким образом, представленные данные показывают, что штамм Вас. сПцгдп 8 тепяя ча . Ецтяса 1 т Ене отличается от известного по продуктив ности и биологической активности, но дополнительно фагоустойчив.И р и м е р. В параллельном опыте в 20 колб емкостью 750 мл было внесено по 30 мл среды, содержащей, г/л: 45 кормовые дрожжи 20,0; кукурузную муку 15,0; воду остальное. До стерилизации рН среды 7,4-7,6. Половина колб засевают штаммом Вас. с)шгтп 8 тепятв чаг. 1 цтвса 1 т Х, а остальные -штаммом Вас. тЬатпрепяя чат. Ептяса 11 Е, Посевная доза составляет17. к объему. Культивирование осуществляют в одинаковых условиях приотемпературе 30+1 С и при скоростивращения качалки 300 об/мин.После22 ч культивирования средний титрспор составляет 3,81+,19 для штаммаБас,сцттп 8 тепятя чат, Еогвсак Х и 3,74+,20 для штамма Вас.сЬпттп 8 т -епяя чаг. )цгясаЕт ЕСпоруляция культуры на производственной дрожжеполисахаридной среде(ДИС) начинается 16- 18 ч, автолиз21-22 ч,Биомасса, выращенная на ферментационной питательной среде, состоитиэ 70 Х спор и ЗОЕ параспоральныхкристаллов,Ьиопробы на насекомых (биологическая оценка) определяют на гусеницахвторого возраста трех видов чешуекрылых вредителей: непарном шелкопряде,капустной совки и пчелиной огневки,Культивирование насекомых и постановку опытов проводят на специальных искусственных питательных средах, Инсектицидную активность бацилл определяютпо интенсивности гибели опытных гусениц при свободном поглощении зараженного корма, Количество погибшихгусениц с пересчетом на контроль подсчитывают на 5-е сут. ЛКяо (в процентах и в миллионах спор на миллнлитры)рассчитывают по формуле Кербера вмодификации Ашмарина и Воробьева.Практическое использование штамма позволяет сократить потери, имеющие место в результате лиэнса культуры наиболее распространенными н производстве фагами.ч о р м у л а изобретенияШтамм бактерий Васд 11 ця сЬтпу- епя 1 я чат. 1 цгяса 1). ВКПИ В, используемый для получения энтомопатогенных препаратов.1530159 нне к фагам аГ 5 3811019 0,019 0,46 19,8 620 6,3 15 7 3, 73+0,23 0,017 О, 43 18,4 604 5,9 14 2-52 тъ к фагу,фагу.2 кормовые дрованое,вначает чувствнтелвносвначает устойчнвоствды 781 С следуоднй масмука 1,5; вода остал е ч Составитель И. За Техред Л.Олийнык Редакт Гратил Подписно ир тиям при ГКНТ СССР по изобретениям и отЖ, Раущская наб.,нного комите 3035, Москваизводственно-издательский комбинат Патент , г,ужгор Гагарина,10 Заказ 7791/3 ВНИИПИ Государст