“способ получения основы микробиологических сред и питательная среда “автофизат” для культивирования микроорганизмов”

(омитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам АНИЕ ИЗОБ(76) Ермишина Инна Георгиевна; Власова ТатьянаФедоровна; Савин Владимир Николаевич(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД И ПИТАТЕЛЬНАЯСРЕДА "АВТОФИЗАТ" ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ(57) Использование: микробиология, касается способа получения основы микробиологических сред,создания новой питательной среды "Автофизат" длякультивирования микроорганизмов и может бытьиспользовано в медицинской и технической микробиологии, молочной промышленности и ветерина -рии, Сущность изобретения: измельченные внутренние органы промысловых рыб смешивают с водой в массовом соотношении 1 1,5, выдерживаютпри 40 - 42 С в щелочной зон рН 7,6 - 8,0 в присутствии хлороформа при перемешивании в течение 2 - 2,5 сут с последующим прогреванием при90 С в течение 5 - 10 мин, осаждением высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точкебелка, отделением нераэгидролизованных белков ивысушиванием конечного продукта Сущность В) Ш 3 (11) 2001101 С 151) 5 С 12 Я 1 20 изобретения: питательная среда "Автофизат" содержит гидролиэат внутренних органов промысловых рыб, лактозу, натрий хлористый, агар и дистил - лированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л: гидролизат внутренних органов промысловых рыб с содержанием аминного азота 100 - 140 мг% 20,0 - 25,0; лактоза 95 - 10,0, натрий хлористый 4,5 - 5,0; агар 0,65 - 0,70; вода дистиллированная остальное. Для увеличения размеров колоний используют модифицированную питательную среду "Автофизат", которая дополнительно содержит пелтон в количестве 14,5 - 15,0 г/и Описанный способ получения основы микробиологических сред позволяет упростить процесс за счет исключения использования дорогостоящих ферментов, а также снизить себестоимость конечного продукта за счет использования дешевого отечественного сырья - белоксодержащих неутилизируемых непищевых отходов рыболовных промыслов. Предлагаемая питательная среда "Автофизат" проста в изготовлении, содержит доступные отечественные компоненты, обладает свойствами эталонных сред для выращивания бифидобактерий и лактобацилл, 2 с и 1 злф-лы 3 табл.11,8 0,1043,4 +0,0512,2 .ф 0,1021,7 0,1528,8 +0,1013,6 . 0,2019,5 +0,0521,1 + 0,10162 й 00532,5 .+0,1017,0 ф 0,1023,0 ф 0,15235 0,109,2 .+0,1514,10,100,033 2,0 2,0 Изобретение относится к микробиологии, касается усовершенствованного способа получения основы микробиологических сред и создания новой питательной среды"Автофизат" для культивирования микроорганизмов и может быть использовано в медицинской и технической микробиологии,молочной промышленности и ветеринарии.Известен способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов путем гидролиза килькипанкреэтическими ферментами в щелочнойсреде в присутствии хлороформа при 50 Св течение суток, остановкой гидролиза прогреванием, осаждением нераэгидролизованных белков и высушиванием конечногопродукта. Ферментативный гидролиэат содержит не менее 18 аминокислот,Однако указанный процесс полученияосновы микробиологических сред включаетиспользование пищевого продукта - килькии дефицитных панкреатических ферментов- источников получения медицинских препаратов,Целью изобретения является упрощение технологии процесса получения основымикробиологических сред и снижение себестоимости конечного продукта за счет использования непищевого отечественногосырья и проведения процесса без внесенияпротеолитических ферментов, а также создания новой простой в приготовлении питательной среды "Автофизат" длякультивирования микроорганизмов.Сущность изобретения заключается втом, что измельченную белоксодеркащуюмассу (гомогенат), состоящую из внутренних органов промысловых рыб, смешиваютс водой в массовом соотношении 1;1,5, выдерживают при 40-42 С в щелочной зонерН 7,6 - 8,0 в присутствии хлороформа приперемешивании в течение 2 - 2,5 сут с последующим прогреванием биомассы при 90 Св течение 5 - 10 мин, осаждением высокомолекулярных соединений в иэоэлектрическойточке белка и высушиванием конечного продукта. Полученный гидролизат имеет следующие физико-химические характеристики:- тонкодисперсный порошок, гидроскопичный, светло-желтого цвета с характернымзапахом без гнилостного;- рН 1-ного раствора 5,5-6,5;- растворимость не менее 5;- массовая доля влаги не более 5;массовая дОляобщего азота 10,0 - 11,0;- массовая доля аминного азота 5,5-6,5- аминокислотный состав 1%-ного раствора (мг 0 ): 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 изолейцинлейцинвалинтреонинсеринметионинтирозинфенилаланинаспарагиновая кислотаглутаминовая кислотапролинглициналднингистидинаргинин0,05триптофан 0,19 +0,05.В качестве сырья для получения основымикробиологических сред используют белоксодержащий непищевой неутилизируемыйотход рыболовного промысла - внутренниеорганы промысловых рыб,Объектом изобретения является такжепитательная среда для культивированиямикроорганизмов.Известна питательная среда для выращивания микроорганизмов, например бифидобактерий, содержащая в г/л;пептон 8,0-9,0лактазу 9,0-10,0-цистин солянокислый 0,1 - 02питательный бульон сухой 12,0 - 13,0экстракт кормовых дрожжей 7,0-8,0аминокровин 150-180вода дистиллированная до 1 л,Однако данная питательная среда (ПС)многокомпонентна, содержит трудноподдающиеся стандартизации ингредиенты (экстракт кормовых дрожжей, аминокровин),что существенно снижает воспроиэводимость результатов, Недостатком этой ПС является также сложная технологияприготовления, дорогостоящие ингредиенты, дефицитные пищевые продукты. Б условиях биотехнологического производствапри использовании больших количеств микробной биомассы использование даннойПС нерентабельно.Для выращивания лактобацилл известна питательная среда Рогозы, содержащихв г/л:пептон 10,0мясной экстракт 10,0дрожжевой экстракт 5,0глюкозу 20,0калий фосфорнокислыйдвузамещенныйнатрий ацетат10 аммоний цитрат 2,0 магний сернокислый 0,2 марганец сернокислый 0,05 твин1 мл воду дистиллированную до 1 л. Питательная среда Рогоэы многокомпонентна, включает нестандартизованное сырье (мясной экстракт, дрожжевой экстракт) и в условиях биотехнологического производства нерентабельна.Для выращивания лактобацилл известно также использование питательной среды МРС, содержащей те же компоненты, что и предыдущая ПС, но вместо мясного экстракта в ней использован гидролизат молока,Однако данная ПС также многокомпонентна, содержит трудноподдающиеся стандартизации пищевые ингредиенты (дрожжевой экстракт, гидролизат молока), что существенно снижает воспроизводимость результатов.Недостатком ПС является сложная технология приготовления, использование дорогостоящих компонентов, дефицитных пищевых продуктов. В условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество ПС для получения микробной биомассы, нерентабельна.Наиболее близкой к предложенной среде является ПС Блаурокка для выращивания бифидобактерий. содержащая в г/л;натрий хлористый 5,0пепто 10,0лактозу 10,01-цистин 0,1агар 0,75печеночный отвар до 1 л.Вышеприведенная ПС также является многокомпонентной, содержит печеночный отвар, исто сник сырья которого нестэндартизован и является дефицитным пищевым продукзол. Технология приготовления ПС сложна, о условиях биотехнологического производства такая среда нерентабельна,Сущность объекта изобретения заключается также в том, что питательная среда "Автофизат" в качестве питательной основы содержи гидролизат внутренних органов промысловых рыб, а также лактозу, натрий хлористый и агар при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной водыгилролизат внутренний органов промысловых рыб с конечнойконцентрацией аминового азота 100-140 мг% 20,0-25,0 лактоза 9,5-10,0 нлтг ий хлористый 4,5-5,0 агар 0,65-0,70 5 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Для увеличения размеров колоний предпочтительно испольэовать модифицированную питательную среду "Автофиэат", которая дополнительно содержит пептон в количестве 14,5 - 15,0 г/л дистиллированной воды. Питательная среда "Автофизат" имеет следующие физико-химические характеристики;- концентрация водородных ионов рН) 6,8-7,0 - аминный азот 100 - 140 мг;6 - влажность (сухойформы) не более 7 оП р и м е р 1. Внутренние органы промысловых рыб (карпа, сома, осетровых и др.) промывают проточной водой, измельчают, разводят дистиллированной водой в массовом соотношении 1;1,5 и проводят гидролиз при 40 С в щелочной зоне рН 7,8 в присутствии хлороформа (1,5 об,о ) при перемешивании в течение 2 сут, В первые сутки гидролиза строго поддерживают рН реакционной смеси, Гидролиз прекращают прогреванием при 90 С в течение 8 мин, при этом коагулируют и выпадают в осадок неразгидролизованные белки, Оставшиеся в надосадочной жидкости высокомолекулярные соединения осаждают в иэоэлектрической точке белка, надосадочную жидкость фильтруот, затем подвергают высушиванию в потоке горячего воздуха в аппаратах, используемых для получения сухого молока. Режим высушивания (на входе 150 - 160 С и на выходе 90 - 95 С) обеспечивает получение сухого препарата с остат- .,:ой влажностью не более 5,0 ,Повышение темпера уры процесса гидролиза до 42 С, увеличе,;, зоны рН до 8,0 и времени процесса до 2,5 сут на олияот на конечные физико-химические характеристики целевого продукта.П р и м е р 2. Подобрана концентрация полученного по примеругидролизата внутренних органов пролысловых рыб, используемого в качестве основы питательной среды, и компонентов среды - лактозы, натрия хлористого и агара. обеспечивающие оптимальные условия роста бифидобактерий и лактобацилл, Использованы следующие штаммы: В,ЬИ 1 онп-производственный Мт 1, 791, ЛВА; 1-р 1 аптагнп 8-РА-З, 1, р 1 ап(агнгп 8 - РА - 3, 3, раптагнгг1.реггпепмгл. Результаты исследования представлены в табл. 1.Как видно из табл, 1, питательная среда на основе гидролизата внутречних органов промысловых рыб при его концентрации в среде от 20 до 30 г/л и концентрациях лактазы - 9,75 г/л, натрия хлористого - 4,75 г/л, агара - 0,68 г/л обеспечивают оптимальные5 10 15 20 ус овия для культивирования бифидобактерий и лактобацилл,Ростстимулирующие свойства этой среды находятся на уровне ростстимулирующих свойств известных питательных сред, Причем при концентрации гидролизата 30 г/л рост бифидобактерий и лактобацилл аналогичен росту бифидобактерий и лактобацилл при добавлении в ПС гидролизата в концентрации 25 г/л, При концентрации гидролизата 15 г/л количество биомассы не уменьшается, однако размер колоний мельче, следовательно оптимальная концентрация гидролиэата внутренних органов промысловых рыб в составе ПС 20-25 г/л.П р и м е р 3, Подобраны концентрации лактоэы, натрия хлористого, агара и пептона в составе ПС для культивирования бифидобактерий и лактобацилл.Концентрации компонентог отрабатывали на шести вариантах ПС, Использованы штаммы В,ЫИбигп 791 и 1 р 1 апагша 8-РА - 3. Из полученных результатов, представленных в табл. 3, видно, что питательная среда на основе гидролиэата внутренних органов промысловых рыб по вариантам ПС с 1 по И обеспечивает оптимальные условия культивирования для бифидобактерий и лактобацилл, не отличающихся от контроля, добавление в зту ПС пептона в количествах, указанных в табл. 2 (ПС по вариантам с 1 Ч по Ч), увеличивает размеры колоний микроорганизмов при том же количестве биомассы. Таким образом, оптимальные соотнош.ния компонентов в описываемой ПС "Автофизат" для культивирования бифидобактерий и лактобацилл следующее, г/л дистиллированной воды:лактоэа 9,5 - 10,0лактоза 9,5 - 10,0натрий хлористый 4,5-5,0 натрий хлористый 4,5-5,0 гидролизат внутреннихорганов промысловыхрыб 20,0 - 25,0 гидролизат внутренних органов промысловых рыб 20,0-25,0 агар 0,65 - 0,70 агар 0,65 - 0,70 пептон 14,5-15,0 П р и м е р 4, Питательную среду "Автофизат" приготавливают следующим образом: к 22,5 г гидролиэата внутренних органов промыслов рыб добавляют 9,75 г лактозы, 4,75 г натрия хлористого, смесь растворяют в 700 мл дистиллированной воды, затем к ней добавляют 0,68 г агара, растворенного в 200 мл воды, общий объм доводят дистиллированной водой до 1 л,25 30 35 45 50 55 Тщательно перемешивают, устанавливают рН раствора 7,0-7,2 и подвергают стерилизации при 110 С в течение 20 мин (автоклавирование), После стерилизации рН питательной среды снижается и становится равным 6,8-7,0,П р и м е р 5. Модифицированную среду "Автофизат" готовят следующим образом; к 22,5 г гидролизата внутренних органов промысловых рыб добавляют 9,75 г лактазы, 4,75 г натрия хлористого, 14,5 г пептона, смесь растворяют в 700 мл дистиллированной воды, затем к ней добавляют 0,68 г агара, растворенного в 200 мл воды, общий объем доводят дистиллированной водой до 1 л. Тщательно перемешивают, устанавливают рН раствора, равное 7,0-7,2, и подвергают стерилизации при 110 С в течение 20 мин (автоклавирование), После стерилизации рН питательной среды 6,8 - 7,0.П р и м е р 6. Проведено изучение влияния ПС "Автофизат", состав которой представлен в примере 4, на культурально-морфологические признаки производчтеенных штаммов В,ЬЮбощ М 1, 791, ЛВА-З, В мазках культур, выросших в высоком столбике ПС "Автофизат", микробы представляют собой грамположительные палочки, характерным признакам которых является раздвоение концов, Часто палочки образуют скопления, напоминающие китайские иероглифы или оленьи рога. При выращивании на ПС "Автофиэат" при температуре 37,5-38,0 С в первые сутки не обнаруживается роста, через 2 - 3 сут формируются колонии бифидобактерий в виде гвоздиков или комет, находящихся во взвешенном состоянии. При испытании модифицированной ПС "Автофизат" добавление пептона) обнаружено, что размер регистрируемых колоний бифидобактерий более крупный (пример 5).Изучено также влияние ПС "Автофизат" (состав указан в примере 4) на культурально-морфологические особенности лактобацилл (.раптагогп 8-РА - 3). Показано, что сохраняются типичные культурально-морфологические признаки данного штамма: грамположительные, в основном, прямые палочки с закругленными концами, расположенные беспорядочными скоплениями и отдельными цепочками по 3-5. При выращивании в ПС "Автофиэат" при температуре 37,5 - 38,0 С в первые сутки наблюдается появление точечных колоний, через 2-3 сут организмы образуют кометообразные колонии,Таким образом, описываемый способ получения основы микробиологических сред(на основе гидролиэата внутренних ор2001101 15 Таблица 1 Количество биомассы бифидобактерий и лактобацилл в ПС на основе гидролизата внутренних органов промысловых рыб в сравнении с контрольной ПСи" вн,й контрл " 20,0 В ЬИсы гэпов промьсловых рыб) предусматривает использование дешевого отечественного сырья - белоксодержащих неутилиэируемых непищевых отходов рыболовных промыслов, имеющихся в стране в больших количествах (тысячи тонн), процесс технологически прост, так как исключает использование дорогостоящих ферментов, предусмотренных способом-прототипом,Описываемая питательная среда "Автофиэат" проста в изготовлении, содержитдоступные отечественные компоненты, не требует дорогостоящего оборудования для своего изготовления, обладает свойствами эталонных питательных среддля выращивания бифидобактерий и лакго;ацп л,(56) Справочник по микробиологическим питательным средам, Под редакциеи5 М.М,Меджидова, Махачкала, 1989, с. 104.Авторское свидетельство ч. 1513029,кл. С 12 11 1/20, 1988,Ое Мап Р,5,йо 9 оза, М.ЯЬагре М,Е.,2001101 12 Продолжение табл. 1 Таблица 2 Составы ПС, использованные для выбора оптимальных концентраций при выращивании бифидобактерий и лактобациллставлена в средних значениях, полученных на основании данных примера 2.13 2001101 4 Таблица 3 Количество биомассы бифидобактерий и лэктобацилл в ПС "Автофизат" в сравнении с эталонными ПСВарианты ПС Би и обакте ии Лактоба иллы Содержание КОЕ/мл/абс,числах/-сред из т ех опытов Размер колоний СодержаниеКОЕ/мл/абс,чисРазмер колонийй лах/-сред из т ех опытов 5,0 10 3,0 10 6,0 10 2,0 10 Равен контролю 5,0 10 9,010 7,0 10 8,010 Равен контролю и Несколько крупНесколько крупнее нее 7,0 10 3,0 10 4,0 10 6,010 Контроли: ПС Блаурокка ПС МРС4,0 10 8,0 10 1-2 мм 1-2 мм Формула изобретения СПОСОВ ОЛУЧО 1 ИЯ ОС 11 ОВ 11 МИКРООИОЛОГИ- чгских сгод и питлтгль 1 ля сгвлл -лвтофизлг 1 л Я культиоиРОВЛ 1 ия МИКРООРГЛ 1 ИЗМОВ1. Способ получения основы микробиологических сред, предусматривающий измельчение белоксодержащего сырья промысловых рыб, гидролиз полученного гомогената о щелочной зоне в присутствии хлороформа при нагревании, последующее прогревание биомассы, осаждение неразгидролизооанных белков и высушиоание, отличающийся тем, что в качестве белоксодержащего сырья используют внутренние органы промысловых рыб, гомогенат которых смешивают с водой в массовом соотношении 1: 1,5, и гидролиз ведут при 40- 42 С в течение 2 - 2,5 сут, а прогреваниепри 90 С в течение 5 - 10 мин,2. Питательная среда для культивирогания микроорганизмов, содержащая питательную основу, лактозу, натрий хлористый, агар и водную основу, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит гидролизат внутрених органов промысловых рыб с содержанием аминного азота 100- 140 мго, а о качестве водной оснооы - воду дистиллированную при следующем соотношении компонен тов, г/л:Гидролизат внутренних органов промысловых рыб с содержанием аминного азота100-140 мг ф 6 20,0 - 25,0 Лактоза 9,5- 10,0 Натрий хлористый 4,5 - 5,0 Агар 0,65 - 0.70 Вода дистиллированная Остальное3, Питательная среда по п,2, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пептон в количестве 14,5 - 15,0 г/л,