Способ количественного определения стероидных гормонов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 33/68 511 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Изобретеожет найт е относится к биохимииприменение в медициэяйстве, эксперимени, С целью повышения не, сельском х й физикидицинский иолог тал точности а обрабатыва ным белком нам (СГ) в гормонов,га А.М.,с 11 ягг 1 Ьцс 1 очаггап1 щепясгца 1есо 1, 1975,ществом ксилапат эавшиеся с исследуемо одеривно Г жащеи Для о СРБ к уще Г, ьной ОПРЕДЕ 54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕНЛЕНИЯ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОН ыделенныи иэ детабл,тка диссоциации Кд более специфическое м связывание гормонаК = 10 э М) этого гормо ния (10 ф связыв онстант М), т,е ание, ч телами твляют следующим соб ос зом Пример 1. Полуского рецепторного б ение специ лка к прог ерону.Специфиче прогестеро ой ткани чеК 1 г тка израствором ованной в и орныи белок из децидуаль ующим образомии рецеп получал овека с от крови и гомогениотмытпри 4 С белок обеспеч с высокой кон ает связыва затор мог оточно тои связыва(21) 4222602/28-14(56) К 1 егя 1 су О,А Ма 1 сащцМ 1 яЬе 11 Э,К, ТЬе погща 1г 1 оп оГ допадо-ггоргпя апягегоЫ ча 1 цея 1 п гЬе погщасус 1 е.Ащег. 1. ОЬягег Вупч.121, р.688-694,Изобретение относится к биохимии,в частности к способам определениястероидных гормонов, и может найтиприменение в медицине, сельском хозяйстве и экспериментальной биологииЦелью изобретения является повышение точности способа.Поставленная цель достигается темчто в качестве гормонсвязывающего вещества используют специфический рецепторный белок к стероидным гормонам, получаемый из децидуальной ткани, а для разделения связанных и несвязанных гормонов используют гидроксилапатит,ализа исследуемыи образец т специфическим рецептор- (СРБ) к стероидным гормо-. присутствии стероидных еченых люминесцирующим СГЛ), Затем с помощью гидта отделяют СГ и СГЛ,свя- СРБ. 0 количестве СГ в образце судят по интенминесценции в фазе, с СГЛ, связанные с СРБ, вления способа используютАПГ, добавляли 5 мл ледяного буфера рН 7,4, содержащего 1 О мМтрис-НС 1, 1,5 мИ ЭДТА и 0,02% азида Иа. Полученную массу осаждалипри 105000 р в течение 1 ч, осадокотбрасывали и в дальнейшем использовали супернатант, содержащий 4,5 мгбелка/мл,Полученный супернатант обрабатыовали в течение 1 ч при 0 С свежеприготовленным раствором трипсина(8 мг/мл 1 мИ НС 1) из расчета 20 мкгтрипсина на 1 мг белка и затем соевым ингибитором трипсина из расчета 152 мкг ингибитора на 1 мг трипсина(для прекращения гидролиза),В полученный гидролизат добавлялимеркаптоэтанол до концентрации1 мМ и затем при О С насыщенный 20раствор сульфата аммония (в 1 мИ ЭДТАи 1 мМ меркаптоэтанола) до 20% пообъему. Эту смесь в течение 40 минразмешивали на магнитной мешалкедля Формирования белкового осадка,и центрифугировали 15 мин при 1000 ц.Осадок отбрасывали, а к супернатантудобавляли насыщенный раствор сульфата аммония в ЭДТА и меркаптоэтаноле до 40% концентрации по объему. 30Белковый осадок из этой смеси формировали на магнитной мешалке и осаждали центрифугированием, Надосадочную жидкость отбрасывали.Полученный осадок растворяли в З 5буфере, содержащем 10 мМ трис-НС 1(рН 7,4),. 1,5 мМ ЭДТАи 1 мИ меркаптоэтанола (ТЭМ). Специфический рецепторный белок к прогестерону выделялииз этого раствора путем гель-фильтрации на колонке (1100 х 20 мм с охлаждением) с сефадексом Г. Фракции, содержащие специфический рецепторный белок к прогестерону (присутствие этого белка определяли с помощью способа рецепторно-люминесцентного анализа) собирали, концентрировали через мембранный Фильтр "Амикон" и дальнейшую очистку проводилиметодом изотахофореза в колонке 200 хх 20 мм с охлаждением в полиакриламидном геле (Т=5,2%, С=3%), содержащем 8 М мочевину, 60 мкл амфолинов(рН 6-8) на 1 мг белка, Ведущим буФером был трис-фосфатный (рн 6,6),замыкающим электролитом - трис-Я --аминокапроновый (рН 8,9), элюционным буфером - ведущий буфер, содержащий 1 мИ меркаптоэтанола. На колонку наносили около 80 мг белка сила то 1ка составляла 5 мА/см геля, скоростьэлюции 15 мл/ч, Время разделения(вьжод Фракции с необходимым рецепторным белком) не превышало 22 ч.После изотахофореза препараты, содержащие специфический рецепторныйбелок к прогестерону, концентрировали через мембранный Фильтр "Амикон"и наносили на колонку (16 х 31 мм сохлаждением) с ДЕАЕ целлюлозой (ДЕ Ьашап), уравновешивали ТЭМ буфе- .ром. Ионно-обменную хроматографиюпроводили ступенчатой элюцией ТЭИбуфером и ТЭМ буфером, содержащим0,15 И КС 1, В белковый раствор,элюированный в присутствии КС 1, при0 С добавляли нейтральный формалиндо концентрации 0,5% и через 45 минвыделенный белок концентрировалина мембранном фильтре "Амикон" (дляудаления триса и НС 1) и лиофилизировали. Лиофилиэированные препаратыбелков-рецепторов к прогестерону хранили в холодильнике и использовалидля определения прогестерона в биологических жидкостях и тканях.Кажду партию лиофилизированногопрепарата специфического рецепторного белка к прогестерону (СРБ) проверяли на титр связывания прогестероном, меченым люминолом (ПЛ). Для этого навеску сухого СРБ растворяли в0,1 И натрий-Фосфатном буфере рН 7,5,содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,1% аэиданатрия (НЭА буфер), и титровали со100 мкл ПЛ. Концентрацию СРБ, связывающую 50% гормона в пробе с 500 пгПЛ, испольэовали в дальнейших анализах как рабочую концентрацию,П р и м е р 2, Определение содержания прогестерона в сыворотке крови.Для исследования брали образцы сыворотки крови трех женщин (16 недельбеременности) объемом по 0,5 мл, кооторые охлаждали до 4 С, и из каждогообразца отбирали по 100 мкл в инкубационные пробирки для последующегоанализа.Для построения калибровочной кривой готовили контрольные образцы,содержащие 100, 200, 500, 1000, 2000,5000 и 10000 пг (пикограмм/мл) прогестерона, по 100 мкл которых такжеотбирали в инкубационные пробирки,В отобранные исследуемые и контрольные пробы добавляли по 100 мклраствора прогестерона, меченого люми5 14906 иолом (ПЛ), содержащего 500 пг/мл ПЛ, и по 100 мкг раствора, содержащего специфический рецепторный белок к прогестерону ( выделенный из дециду5 альной ткани, как описано н примере 1) в количестве 1,1 мг/мл, обеспечивающем связывание 507, ПЛ в пробе, содержащей 500 пг ПЛ (см,пример 1).10 Полученные смеси инкубировали при 4 С и встряхивании в течение 60 мин (во время инкубации происходит образование комплекса прогестеронрецепторный белок).Для отделения прогестерон-рецептоного комплекса от свободного прогестерона и остальных компонентов сыворотки крови в каждую проинкубированную пробу добавляли гидроксилапатит в количестве 30 мкг и выдержиовали при 4 С в течение 1 О мин, Проинкубированныепробы - гидроксилапатит с прогестерон-рецепторным комп лексом - наносили на фильтры (каждую на 1 фильтр) и промывали холодным НЭА буфером (0,1 М натрий-фосфатный буфер рН 7,5, содержащий 1 мМ ЭДТА и 0,17 азида натрия). Затем30 каждую пробу переносили (вместе с Сравнительная характеристика специфичности и чувствительности способов РИА и РЛА при определении прогестерона Количествоизмерений Исследуемая среда Количество прогестерона,мг/мл Стандартминимальное 0,16 ф 0,01 0,16 0,008 количествоБеременность:9 недель16 недель 24, 114 1, 9340,86+3,61 23,47 Ф 0,9639,62+1,79 1исследуемую пробу по 100 мкл 10 М 50 пероксидазы хрена и 10 Г 1 Н Ои сра эу же измеряли в люминометре интенсивность люминесценции каждой иэ пробэа период 20 с,Из таблицы видно, что при количе ственном определении прогестерона встандартных растворах точность, аследовательно, и специфичность РЛАи РИА почти одинаковы, Однако, приопределении гормона в сыворотке кроСодержание прогестерона в сыворотке крови определяли методами РИА и РЛА у 8 женщин, имеющих 9 недель бе" ременности, и у 8 женщин, имеющих ,16 недель беременности,В каждый флакон добавляли по 10 мкл 5 М ЯаОН и инкубировали при 60 С 60 мин, Пробы охлаждали до комнатной температуры, отбирали иэ них для дальнейшего исследования по 300 мкл жидкости, добавляли в каждую 50 ефильтром) в отдельный флакон и заливали НЭА буфером (по 200;кл в каждую пробу).Для отделения изолюминола отпрогестерон-репептарного комплексак пробам добавляли по 100 мкл 5 МоИаОН и инкубировали при 60 С60 мин,Пробы охлаждали до комнатной тем.пературы, отбирали по 300 мкл (пилеткой с фильтром) и помещали их вкюветы люминометра.Затем в пробы добавляли до 100 мкл10 М раствора пероксидаэы хрена ине позже чем через 30 с вносили по100 мкл 10 М Н О,Интенсивность хемолюминесценции измеряли в люминометре в течение 20 с и полученные значения испольэовали для построения калибровочной кривой (зависимость интенсивности люминесценции от концентрации прогестерона в контрольных пробах) и определения количества прогестерона в пробах сыворотки крови обследуемых женщин,Минимальное количество прогесте -рона, определяемое в стандартных пробах различными способами, представлено в таблице,1490650 ви беременных женщин (различных сроков беременности) специфичность РЛАболее, чем в 2 раза выше специфичСоставивитель М.Пустынников Редактор А.Лежнина Техред Л.Олийнык Корректор М,МаксимишинецЗаказ 3751/54 Тираж 789 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 1 О 1 ности РИА.5 Формула изобретения Способ количественного определения стероидных гормонов путем обработки сыворотки крови гормонсвязывающим веществом в присутствии меченых стероидных гормонов, удаление свободных гормонов с последующим определением количества метки во фракциисвязанных с антителами гормонов,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения точности способа, вкачестве гормонсвяэывающего вещества используют рецепторный белок иэдецидуальной ткани, а для удалениясвободных гормонов используют гидроксилапатит.1