Способ получения иммобилизованных ферментов

) 484250 СПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советскни Соцмапистическмх Республик(51 1) 1980567/28-13 2) Заявлено 27,12.с присосдиненпс3) Приоритст -убликовано 15,09.7заявки-осударстоеииыи комитетСовета Мииистроо СССРро делам изобретенийи открытий, Бюллетеньта опубликования описания 22.03) Заявитель О ОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ 54) С ПО или пиридиниевые основания (производные полистирола), алкилированный аминоэфир полиметакриловой кислоты.Для наиболее полной иммобилизации в 5 гель исходного количества фермента компоненты геля берут в соотношении, соответствующе максимальному количеству образующегося геля. Для этого получают зависимость оптическоп плотности смеси, образующейся 10 при смешивании растворов поликатионов иполиапиопов, в одном из которых растворен фермент, от состава смеси. Состав смеси, имеющий максимальную оптическую плотность, обеспечивает получение максимального 15 количества геля.Образующийся при смешивании растворовполикатиона и полианиона осадок, содержащий фермент, отделяют от пасадочного раствора декантацией или, для получения более 20 плотного геля, центрифугированием, промывают дистиллированной водой и оставляют на срок не менее 24 ч под слоем дистиллированной воды. По истечении этого периода образуется ферментативно активный гель, сохра няющий свою активность в течение нескольких месяцев. Гель можно хранить в высушенном виде. При последующем набухании его активность полностью сохраняется, Иммобилизованный в геле фермент действует на низ- ЗО комолекулярные и высокомолекулярные субмикробиологиче промышленно олучения иммоИзобретение относится кской, медицинской и пищевойсти, в частности к области пбилизованных ферментов,Известен способ получения иммобилизованных ферментов путем смешивания их растворов с веществами, образующими гель, в качестве т(оторых используют полиапионы, с последующим отделением образующегося осадка гель-фермента и его промывкой. Одна(о фермент, имобилизованный таким образом, недостаточно прочно закрепляется в геле и может вымываться в процессе использования,Для получения более стабильных ферментов предлагается наряду с полианионами в качестве вещества, образующего гель, вводить раствор поликатиона.В качестве полианионов используют синтетические и природные поликислоты, например кислые полисахариды или полиамфолиты, при рН выше их изоэлектрической точки, такие как альгинат натрия, пектин, каррагинан, гепарин, полиакриловая кислота, полигалактуроновая кислота, декстрансульфат натрия. В качестве поликатионов используют синтетические и природные полиоснования или полиамфолиты, например белки, при рН ниже их изоэлектрической точки, такие как полилизин, альбумин, эдестин, четвертичные аммониевые до, Е, С. Ваинерман,А. Стрельцова веских соединений АН СССРЗо 35 40 45 50 55 3раты, при этом его действие мало зависит от степени дисиерсности геля,П р и м е р 1. Приготавливают 10вес, % раствора альгината натрия и алкилированного аминоэфира полиметакриловой кислоты. В последнем растворяют трипсин до содержания 10-ф вес. . . Получают зависимость от состава оптической плотности системы, образованной смешиванием различных объемов указанных растворов при рН 8,0 и 8 С. Наибольшая оптическая плотность системы соответствует соотношению смешиваемых объемов растворов альгината натрия и аминоэфира 31:73 (соответственно). Исходя из этого соотношения, к 62 мл 0,5%-ного раствора альгината натрия приливают по каплям при перемешивании 73 мл 1%-ного раствора алкилированного аминоэфира полиметакриловой кислоты, содержащего 1 вес. Отрипсина.Образующийся при сливании растворов осадок отделяют центрифугироваием. Надосадочный раствор не обладает ферментативной активностью. Осадок промывают дистиллированной водой и оставляют под слоем дистиллированной воды на 5 суток. Активность полученного иммобилизованного трипсина, измеренная по скорости гидролиза этилового эфира Х-бензоил.-аргинина, составляет 1/о от активности такого же количества фермента в нативном состоянии. Фермент не вымывается дистиллированной водой и 0,1 М раствором МаС 1. Активность препарата не меняется в течение пяти месяцев, Препарат используют как наполнитель колонки, через которую в течение двух суток пропускают 10 - "/о-ный раствор казеина. Эффективность колонки, определяемая по числу разорванных ферментом пептидных связей, в течение двух суток непрерывной работы не меняется,П р и м е р 2, Как в примере 1, определяют оптимальное соотношение объемов растворов альгината натрия, содержащего а-химотрипсин, и аминоэфира полиметакриловой кислоты, соответствующее максимальной оптической плотности системы. Исходя из этого соотношения, к 20 мл 0,5%-ного раствора альгината натрия, содержащего 0,5% а-химотрипсина, прибавляют по каплям при перемешивании 25 мл 1/О-ного раствора алкилированного аминоэфира полиметакриловой кислоты; рН растворов 8,0, температура 8,0 С. Образующийся при сливании растворов осадок промывают водой и оставляют под слоем дистиллированной воды на 5 суток, Активность полученного иммобилизованного и-химотрипсина, измеренная по скорости гидролиза этилового эфира К-ацетил-.-тирозина, составляет 154от активности такого же количества фермента ь нагивном состянин. Лктнвносгь сохраняе ся неизмененной в течение по меньшей мере пяти месяцев.П р и м ер 3. Как в примере 1, определяют оптимальное соотношение объемов растворов альгипата натрия и желатипы, содержащей рибопуклеизу, соответствующее максимальной оптической плотности системы. Исходя из этого соотношения, к 2 мл 1%-ного раствора альгината натрия прибавляют по каплям при перемешивании 10 мл 0,8/о-ного раствора желатины, содержащего 0,02 г рибонуклеизы; рН растворов 4,2, температура 40 С. Образующийся осадок промывают водой и оставляют под слоем дистиллированной воды на 5 суток. Активность полученной иммобилизовапной рибопуклеизы, измеренная па спектрофотометре на длине волны 292 нм по скорости гидролиза цитидин,3-циклофосфата, составляет 1/о от активности такого же количества фермента в нативном состоянии.Пример 4. К 1,6 мл 1/о-ного раствора декстрансульфата натрия прибавляют по каплям при перемешивании 8,4 мл 0,5 -ного раствора альбумина, содержащего 0,5% рибонуклеизы. Полученный гель обладает рибонуклеизной активностью. Предмет изобретения 1. Способ получения иммобилизованных ферментов путем смешивания их растворов с растворами вещества, образующего гель, в качестве которого используют полианионы, с последующим отделением образующейся дисперсии гель-фермента и его промывкой, отличающийся тем, что, с целью получения более стабильных ферментов, наряду с полианионами в качестве вещества, образующего гель, вводят раствор поликатиона.2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве поликатионов используют полиоснования и белки.3. Способ по пп, 1 и 2, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности, образующийся гель-фермент после промывки выдерживают в среде с низкой ионной силой, например в дистиллированной воде в течение 5 суток.4. Способ по пп. 1 - 3, отличающийся тем, что, с целью наиболее полного включения фермента в гель, смешивание растворов полианионов и поликатионов осуществляют в соотношении, соответствующем максимальной оптической плотности полученной дисперсии, определяемой экспериментальным путем,