Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) (1 15040 0 ИТЕТРЫТИЯМ ГОСУДАРСТВЕННЫИПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ ГННТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и ный меди 8)ЛЕНИЯ АЭЫВ ЭР ТИВНОСТИИТРОЦИТАХ(57) Изобретени медицины и може для целей диагн относитбыть исстики. Дллутатионп к областльзовано активности оксидазы Изоб ческой(71) Минский государствецинский институт, КРОВИе ретение относится к биолог химии и медицине и может и аться для определения акти ерментов крови.изобретения - разработка определения активности глу ероксидазы в эритроцитах кр ви.Способ осуществляется следуюобразом Определение активности глу онпероксидазы в эритроцитах.За меру активности глутатионпероксидазы принимают скорость окисления глутатиона в присутствии гидро- перекиси третичного бутила. Концентрацию глутатиона до и после инкуба,ции в предлагаемой среде с помощью 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (ДТНБК) определяют колориметри,чески. Количество образующегося продукта - тионитрофенильного аниона спользуют среду инкубации, содержащую: трис(гидроксиметил)аминометан (трис)-НСХ буФер 1 00 ммоль, рН 8,5; этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) 4,0 ммоль; азид натрия 10,0 ммоль; глутатион 4,0 мысль;гидроп ер екись третичного бутила, При этом колориметрически измеряют скорость окисления глутатиона с помощью 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты при 412 нм, Способ позволяет определять активность глутатионпероксидазы цельной крови, эритроцитов и тромбоцитов. 1 табл 3 ил.(ТНФА) - прямо пропорционально количеству сульфогидрильных групп глутатиона, прореагировавших с ДТНБК.Реактивы: трис-НС 1 буфер 100 ммоль, рН 8,5, содержащий 4,8 ммоль ЭДТА, 12 ммоль азида натрия и 4,8 ммоль глутатиона (о); гидроперекись третичного бутила 20 ммоль/л ; трихлоруксусная кислота (ТХУ) 200 г/л (6); ДТНБК на метаноле 1 О ммоль/л (2); трис-НС 1 буфер 100 ммоль/л, рН 8,0 ..В качестве антикоагулянта исполь эуют ЭДТА (1 мг на 1 мл крови).Эритроциты промывают холодным из тоническим раствором хлорида натрия (9 г/л) с рН 7,4, центрифугируют 30 мин при 4000 об/мин и 4 С, гемолизируют равным объемом дистиллированной воды и повторным замораживанием и оттаиванием, Гемолизат разводят водой до концентрации по гемоглобину 10 г/л,Ход исследования: 100 мкл гемолизата преинкубируют с 830 мкл реактиова а 10 мин при 37 С, добавляют70 мкл реактива и и инкубируют точно 5 мин. Реакцию останавливают,цобавлением 200 мкл реактива 5,осажденные белки удаляют центрифугированием. 100 мкл надосадочной жидкостивносят в 9,9 мл реактиваи добавляют 100 мкл реактива й . Фотометрируют при 41 2 нм, толщина оптического слоя кюветы 10 мм, Контрольнаяпроба отличается тем, что гемолизатвносят в инкубационную среду непосредственно перед осаждением белковреактивомС учетом разведения гемолизатаи коэффициента молярной экстинкцииТНФА при 412 нм - 11400 рассчитываютактивность глутатионпероксидазы вмикромолях израсходованного в реакции субстрата (глутатиона) по Форму= мкмоль/мин/1 г гемоглобина, гдеОП - оптическая плотность,На Фиг,1 показана зависимостьактивности глутатионпероксидазы (ГП)эритроцитов от концентрации гидроперекиси третичного бутила в среде.Из представленных данных следует,что насыщение Фермента ГП эритроцитов этим субстратом достигается приконцентрации его в среде 1,4 ммоль,На Фиг.2 показана скорость окисления глутатиона в предлагаемой среде в присутствии глутатионпероксидазы донорской крови (эритроцитов),Изпредставленных данных следует, чтолинейная зависимость между скоростьюокисления глутатиона (по разницеоптических плотностей (ОП) контрольной и опытной проб) и временем инкубапии в предлагаемой среде сохраняется в пределах не менее б мин.На Фиг. 3 показана зависимостьмежду активностью ГП эритроцитов и количеством фермента в пробе (относительно количества гемоглобина гемолизата), измеренная в предлагаемой среде. Из представленных данных следует, что эта линейная зависи" .мость сохраняется в широком диапазоне активности ГП, по меньшей мере до 1 000 мкмоль/мин/1 г гемоглобина.гоПредлагаемый способ специфичен.В таблице суммированы результатыпроверки специфичности способа определения активности ГП эритроцитов вприсутствии ингибитора ГП (монойод-.ацетат), который полностью подавляетФерментативную активность (на 98,8++ 0,8 %); обработка гемолизататрансформируюшим раствором практически не влияет на результаты анализа:подавление потенциальной псевдопероксидазной активности гемоглобинатрансформацией последнего в цианметгемоглобин статистически недостоверно (0,47+ 1,01%),Предлагаемый способ может быть использован при определении активности ГП цельной крови и эритроцитов.ЗО Формула из обретенияСпособ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах крови, включающий помещение их в среду инкубации, содержащую 100 ммоль трос -НС 1 рН 8,5, 4 ммоль этилендиайинтетраацетата натрия, 10,0 ммоль рН 8,5, 4 ммоль этилендиаминтетраацетата натрия, 10,0 ммоль азида натрия, 4 ммоль глутатиона, добавление к смеси 1,4 ммоль гидроперекиси третичного бутила, обработку пробы трихлоруксусной кислотой, удаление белкового осадка, добавление к надосадочной жидкости 5,5-ди-тиобис(2-нитробензойной) кислоты с последующим спектроФотометрическим измерением оптической плотности при 41 2 нм.1471134 Гемолиэат Донор обработанныймонойодацетатом нативный обработанныйтрансформирующим раствором Ингибирование,7 АктивАктивингибирование,Я ность,мкМ/мин/1471134 ГПмиолькои 11 г аеиолобцио ЕЮО800ЕОО Ю8 708,5)О Геиоилобии г/ю Составитель Д,ПопоТехред А.Кравчук орректор М;П едактор Е.П Заказ 1603/47 Тираж 788 Подписное при ГКНТ СССР 1 ИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открыти 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/ роизводственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101