Способ проведения иммуноанализа

СООЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 19) (11) 4089 А 4 С 01 М 33/5 ОПИСАН ЕТЕНИЯ спользоалл опорнтенснв иммуно реагенных метал- иммунолосле с учаси детекцию по Фосфопроводится разрешеной темпеНАЛИВА одамя увствиельность способа ставля вля- имоль/л . ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР Н АВТС 1 РСНСМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ИИМУНОА(57) Изобретение относится к метпроведения иммуноаналиэа и можетбыть использовано в медицине, сельском хозяйстве, нромьпппенности длопределения биологически активныхсоединений. Целью изобретения яется увеличение чувствительности Изобретение относится к методам проведения иммуноаналиэа и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве промышленности для определения биологически активных соединений.Цель изобретения - увеличение чувствительности способа за счет использования металлопорфиринов в качестве маркеров,На Фиг, 1 приведен спектр поглощения РЙ-копропорфирина 1 в водном растворе (максимумы поглощения 396,514 и 548 нм); на фиг. 2 - корректированный спектр испускания РЙ- копропорфирина 1; на Фиг. 3 - зависимость интенсивности люминесценции от концентрации: 1)РЙ-копропорфирин 1 (возбуждение при 395 нм, регистрамуноаналиэа. В качестве мепроведении иммуноанализа иваны соединения класса метфиринов, которые способныфосфоресцировать. Проведенианализа включает получениетов, ковалентно маркированлопорфиринами, проведениегических реакций, в том читкем меченных соединений,специфического связыванияресценции метки. Детекцияс мкросекундным временнымнием в растворе при комнатратуре или в жидком азоте ция при 665 нм); 2) европий (возбуждение при 337 нм, регистрация при 616 нм); на Фиг. 4 " калибровочная кривая для определения моноклональных антител твердофазным методом (концентрация меченных антител на второй стадии 30 н,моль/л).П р и м е р 1. Получение Рй(2+)- копропорфирина 1. К раствору 72,7 мг копропорфирина 1 дигидрохлорида в 40 мл ледяной уксусной кислоты добавляют приготовленный раствор 75 мг РИС 1 в 15 мл свежеочищенного диметилформалина и нагревают смесь в течение 1 ч при 120 С (спектрофотометрический контроль при длине волны 620 нм до полного исчезновения полос поглощения безметального порфирина в растворе диметилформамида). К го1464089 Способ проведения иммуноанализа путем получения антител или антигенов, меченных люминесцирующими соединениями, проведения иммунохимической .реакции с последующей детекцией специфического связывания по интенсивности люминесценции, о т л и ч аю щ и й с.я тем, что, с целью увеличения чувствительности способа, в качестве люминесцирующего соединения используют Фосфоресцирующие металло- порфирины, а детекцию специфического связывания ведут по интенсивности Фосфоресценции. рячему раствору добавляют 1,5 мл во,ды и постепенно охлаждают до комнатной температуры. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, про- мывают 10 мл уксусной кислоты, затем водой и этанолом и высушивают в вакуумном эксикаторе. Выход Рй(2+)- копропорфирина 1 65 мг (85,7 ), Спектры поглощения и фосфоресценции при ведепы на Фиг. 1 и 2. Время жизни фосфоренсценции в обескислороженном водном растворе при 20 С 0,67 мс.Квантовый выход фосфоресценции 0,20.П р и м е р 2. Получение антител, 15 маркированных Рй(2+)-копропорфирином 1, К 1 мг Рй(2+)-копропорфирина 1 в 1 мл воды добавляют 1,5 мг 1-циклогексил-(2-морфолиноэтил)карбодиимидамето-и-толуолсульфоната и инкуби руют 15 мин, поддерживая рН 5,8-6,2. Полученный раствор добавляют к 20 мг моноклональных антител, растворенных в 2 мл О, 1 М карбонатного буфера, рН 9,0, и инкубируют 3 ч в темноте.Полученный раствор хроматографируют на колонке с носителем Тоуореаг 1 НЮ, собирая фракции белкового пика.Содержание Рй(2+)-копропорфирина в меченном белке определяют по погло- ЗО , щению при длинах волн 280 и 390 нм.Чувствительность детекции на импульсном люминесцентном спектрометре 1.8-5 (РегЕп Е 1 шег) с временным разрешением антител, меченных Ро-копропорФирином 1 (состав 1:3), ве уступает чувствительности европневой метки, в определении на этом же приборе, и составляет 0,01 нМоль/л (Фиг.3).П р и м е р 3. Проведение твердо фазного иммуноанализа. На. поверхность полистирольных пробирок адсорбируют антитела кролика против глобулинов мыши из 1 мл 0,1 М карбонатного буфера в концентрации 10 мкг/мл в течение 3 ч при комнатной температуре.Затем раствор выливают и промывают пробирки 3 раза фосфатно-солевым буфером с Тритоном Х(К-Фосфат 0,01 М, рН 7,4, ИаС 1 0,15 М, 0,05%-ного Тритона Х 100; ФСБТ).В пробирки с адсорбированными антителами наливают по 1 мл стандартных растворов моноклональных антител в ФСБТ и инкубируют 1 ч при 37 оС. После этого растворы выливают, промывают пробирки 2 раза ФСБТ, заливают в них по 1 мл ФСБТ, содержащего 10 мкг моноклональных антител, меченных РЙ-копропорфирином 1, и инкубируют 1 ч при 37 С в темноте.Затем растворы сливают, промывают пробирки 3 раза ФСБТ, заливают в них по 1 мл десорбирующего раствора (О, 1 М ИаОН). Через 20 мин добавляют 0,1 мл 1 М раствора бисульфита натрия и измеряют интенсивность Фосфоресценции.П р и м е р 4. Регистрация фосфоресценции. Возбуждение проводят азотным лазером (337 нм) с частотой 50 Гц и полушириной вспьппки 10 нс. На регистрации используют фильтры, отсекающие кванты с длинами волн менее 620 нм. Время задержки 0,3 мс, счет 0,7 мс, время счета 1 с. Калибровочная кривая приведена на фиг. 4. Чувствительность анализа 0,01 нмоль/л,Формула из обретения1464089 Ф,О уиИ 4 Саб .ова Составитель А. УрГорная Техред М,Дидык Корректор Н. Корол акт енно-иэдательский комбинат "Патент", г. Ужг ул. Гагарина,1 Прова 3,5 Я,О Заказ 819ВНИИПИ Го Тираж 788 арственного комитета по 113035, Москва, ЖПодписноебретенням и открытиям при ГКНТ СССРаушская наб д. 4/5