Способ определения активности антитромбина ш в плазме крови

(19) Ш) 09 И 4 С 01 И 33/68 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ рственныи медиЛенинского комторныегемоста а 1980,те ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Алтайский госудацинский институт им.сомола(56) Балуда В.П., БиркаганГольдберг Е.Д. и др, Лаборметоды исследования системьза./ Под ред. Е.Д.ГольдберТомск: Томский мединститутс, 199. Изобретение относится к медицине, именно к лабораторной диагностике арушений свертываемости крови.Цель изобретения - повышение точости способа в условиях гепаринорапии.Цель достигается тем, что в способе определения активности антитромбина (АТ) 111 в плазме крови, включающем связывание АТ 111 дефибринированной плазмы экзогенного тромбина, где об активности АТ 111 судят по активности остаточного тромбина, удаление гепарина из плазмы осуществляется путем адсорбции сульфатом бария.Способ осуществляют следующим об, разом.Реактивы: 3,87-ный раствор цитрата натрия, буфер Михаэлиса, рН 7,4, рабочий раствор тромбина (Каунасское предприятие бакпрепаратов) в буфере,:(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИАНТИТРОМБИНА 111 В ПЛАЗМЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к лабораторной диагностике, 11 ель изобретения - повышение точности способа вусловиях гепаринотерапии, Рабочийраствор тромбина прогревают и добавляют к нему исследуемую дефибринированную адсорбированную плазму, которую предварительно обрабатывают сульфатом бария. После инкубации смесьпереносят в пробирку с раствором фибриногена и регистрируют время свертывания. По калибровочной кривой находят процентное содержание антитромбина 111. 5 табл. 2 С:Михаэлиса, рабочий раствор фибриноге на (Каунасское предприятие бакпрепаратов) в буфере Михаэлиса, сульфат фффффбария.Приготовление исследуемой плазмы,Из вены обследуемого силиконированной иглой берут кровь и смешивают еев силиконированной пробирке с О3,87-ным раствором цитрата натрия в ювсоотношении 9:1, затем центрифугируют 6 мин при 300 об/мин. Снимают бо 1 гатую тромбоцитами плазму и вновьцентрифугируют ее в силиконированной пробирке при 1200 об/мин в течение 20 мин. В полученную беднуютромбоцитами плазму добавляют сульта,фат бария из расчета 900 мг/мп, затем в течение 5 мин тщательно пере"мешивают их стеклянной палочкой,После этого центрифугируют при300 об/мин б мин. Плазму снимают, 1464090Проверки качества адсорбции прово"дятся с помощью определения протромбинового времени по Квику, которое вхорошо адсорбированнОй плазме должнопревышать. 3 мин при активности добавляемого тромбопластина (проверяется на контрольной нормальной плазме) 15-20 с, Адсорбированную беднуютромбоцитами плазму прогревают на 10оводяной бане при 56 С в течение5 мин. Пс" че тепловой дефибринацииосаждают фибриноген центрифугированием (10 мин при 1200 об/мин), Надосадочный слой снимают для проведения 15исследования.Приготовление рабочего растворатромбина. Разводят тромбин в небольшом количестве буфера Михаэлиса (маточный раствор). Часть маточного ра цствора постепенно разводят буферомИихаэлиса, проверяя его коагуляционную активность добавлением 02 млраствора тромбина к 0,3 мя раствораФИбриногена. Свертывание должно происходить за 15-16 с. При избыточномразведении для повышения коагуляцлонной активности добавляют маточныйраствор тромбина. Рабочий раствортромбина готовят непосредственно пе- ЗОред исследованием, так как он быстротеряет свою активность,Приготовление рабоч его раствораФибриногена. Навеску сухого фибрино гена растворяют в буфере Михаэлисадо концентрации 0,63, Затем по мето"ду Рутберг определяют "одержание коагулирующего белка (с добавлением15-секундного тромбина) и вновь добавляют буФер .Михаэлиса, доводя концентрацию коагулирующего белка до.0,43,Ход определения . В силиконированную пробирку набирают 0,8 мл рабочего раствора тромбина, прогревают егона водяной бане при 37 С в течение2 мин и добавляют к нему 0,2 мя исследуемой дефибринированной адсорбированной.плазмы и немедленно включа"ют секундомер. Ровно через 3 мин инкубации этой смеси на водяной бане .при 37 С 0,2 мп ее переносят в пробирку с 0,3 мл рабочего раствораФибриногена, предварительно такжепрогретого в течение 1 мин при 37 С,Немедленно включают второй секунцомери регистрируют время свертывания, Покалибровочной кривой находят процентное содержание АТ 111. Построение калибровочной кривой. Цитратную плазму, полученную у 10 здоровых людей, адсорбируют и дефибринируют по указанной методике, после чего все образцы смешивают в равных объемах в одной пробирке. Эту смесь разводят буфером Хихазлиса в 2,4,8 и 16 раз, чем достигается сни- жение концентрации АТ 111 соответственно до 50", 25, 12,5 и 6,257По указанной методике определяют активность АТ 111 каждого разведения в секундах (измерения проводятся трижды и при совпадении результатов берется их среднее арифметическое). На кривой разведения по оси ординат откладывается десятичный логарифм времени свертывания в секундах, а по оси абсцисс - активность АТ 111 в процентах в соответствии с приготовленными разведениями.Выработка режимов адссрбции. Проводится исследование влияния концентрации сорбента на степень удаления факторов свертывания (по протромбиновому времени) и активность АТ 111 (по кривой, построенной на адсорбированной плазме),Данные приведены в табл. 1.Установлено, чтс активность АТ 11 стабилизируется при 5-)ин.,:ной адсорбпии с сульфатом бария в концентрации 400 мг/мл. Дальнейшее увечичсние концентрации сорбента не влияет на определяемую активность АТ 111.ДлЯ исключениЯ воз мо)кног о влиЯниЯ факторов свертывания, удаляемых сульфатом бария, на степень адсорбции гепарина используется ад с ор бир ованная плазма, в которой определяется тромбиновое время, а затем после гепаринизации проводится адсорбция.В табл. 2 представлена зависимость между степенью гепаринизации плазмы и концентрацией сорбента, достаточной для полного удаления гепарина (при 5-минутной адсорбции).Для определения взаимодействия гепарина и факторов сверть:вания удаляемых сульфатом бария,. определяется активность АТ 111 (по кривой, енной на адсорбированной плазме) при различных степенях адсорбции в плазме с гепарином и без него (табл, 3).Установлено (табл, 3), что концентрация сульфата бария рекомендуемая для адсорбции является достаточнойри низир ова иная в концентрации3 ед/мп 100 200 400 100 100100100100 6008009001000 для удаления факторов свертывания и гепарина в концентрации 3 ед/мл плазмы и составляет 900 мг/мл плазмы.П р и м е р 1. Больная А., 32 го 5 да.Диагноз: сепсис, двусторонняя септическая пневмония, ДВС-синдром.В качестве базисной терапии ДВС- синцрома больной подкожно вводили гепарин в суточной дозе 20 тыс.ед.Результаты лабораторного исследования системы гемостаза приведены в табл, 4,Известным способом выявилась ложно высокая активность АТ ЕЕЕ, что 15 объясняется влиянием гепарина.Выявленное предлагаемым способом снижение активности АХ ЕЕЕ явилось показанием для проведения коррекционно-заместительной терапии свежезамо роженной плазмой в дозе 600 мл.П р и м е р 2. Больная С., 37 лет. Диагноз: сепсис, ДВС-синдром.В качестве базисной терапии ДВС- синдрома больной подкожно вводили ге в парин в суточной дозе 25 тыс. ед.Результаты лабораторного исследования системы гемостаза приведены в табл. 5. 30Таким абра з ом, несмотря на с нижение активности АТ ЕЕЕ, определяемое известным способом, данные цифры являются завышенными, а действительное снижение активности АТ ЕЕЕ, определяемое предлагаемым способом, является гораздо более глубоким.Таким образом, при гепаринотерапии известный способ дает завышение результатов, тогда как результаты, полученные с помощью предлагаемого40 способа, не зависят от присутствия в плазме гепарина. Формула изобретения4 Способ определения активности антитромбина ЕЕЕ в плазме крови, включающий обработку дефибринированной 1плазмы зкзогенным тромбином с последующей оценкой активности анти,тромбина ЕЕЕ по активности остаточного тромбина, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точусловиях гепаринотеобработку плазмыв количестве 900 мг Протромбиновое АктивКонцентрация ге- Концентрация сорпарина,ед/мл бента, мг/мп Не определяетсяНе определяетсяНе определяется180 80100 1001464090 Та блица 4 Больная Контроль Тест Активированное парциальное тромбопластиновоевремя, сЭтаноловыйПротаминсульФатный Количество тромбоцитов Активность АТ 111, У.,по способу известномупредлагаемому 40 48 Положительный Отрицательный Положительный Отрицательный 15110/л 14055 100 100 Та блица 5 Контрольв Больная Тест Активированное парциальноетромбопластиновое вреьщ, сЭтаноловый,ПротаминсульфатныйКоличество тромбоцитов 49Положительный Положительный 55 Отрицательный Отрицат ельный 90 10 /л Активность АТ 111, % поспособу известномупредлагаемому 100 100 60 25 Составитель Л. ПотемкинРедактор И.Горная Техред М.Дндык . Корректор О. Кравцова Заказ 819/48, Тираж 788, Подписное ВНИИЛИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5юттю веею Юв е ее веетютюю ет ю вввт ю вевПроизводственнотиздательский комбинат "Патент" г,ужгород, ул. Гагарина,101