Способ получения иммобилизованного протосубтилина

,( В ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ СДНИК ИЗОБР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТ(71) Институт цитологииСО АН СССР и Бердский,.завод(53) 57.15(088.8)56) Маес 1 а Н. е. а 1. ВоесЬпо 1 окуоепя. 1973, 15, р. 607-609.Земцова Л.В. и др. Иммобилизацияпротосубтилина и исследование свойствиммобилизованного фермента. - В кн.:Иммобилизованные протеолитическиеферменты в лечении гнойно- некротических процессов. - Новосибирск: ИЦи ГСО АН СССР, 1981, с. 9-23.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ПРОТОСУБТЙЛША(57) Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности,а именно к биологически активным соединениям, конкретно к иммобилизованным протеазам, которые могут бытьиспользованы в производстве биопрепаратов, добавок к синтетическим моющим средствам, парфюмерии, ветеринарии, медицине. Цель изобретения - повышение качества целевого продукта,Способ заключается в иммобилизациипротосубтилина на органическом носителе, В качестве носителя используютполиэтиленоксид с мол.м. 600-2000 ки- Ялодальтон при соотношении носителяи фермента 1:7,5-1;8,5. Смесь носите- ЪФ Уля и фермента в водном растворе под- (вергают обработке -лучами дозой 2,32,7 мрад. Полученный препарат обла- фдает повышенной активностью и термостабильностью и, кроме того, активен фв более широком диапазоне рН. 4 ь4 ьИзобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к биологически активным химическимсоединениям, конкретно к иммобилизованным протеазам, которые могут бытьиспользованы в производстве биопрепаратов, добавок к синтетическим моющимсредствам, парфюмерии, ветеринарии,медицине и т.д. 10Цель изобретения - повышение качества иммобилизованного протосубтилина.Способ заключается в иммобилизациипротосубтилина на полиэтиленоксиде с 15мол. массой 600-2000 к 0 при соотношении носителя и фермента 1:7,5 - 1:8,5.Смесь носителя и фермента в водномрастворе подвергают обработке-лучамив дозе 2,3-2,7 мрад, 20Связанные между протосубтилиноми полимерным носителем осуществляется радиохимический воздействиемв растворе. Это позволяет получатьконечный продукт в виде водного раствора иммобилизованных протеаз, обладающих высокой протеолитической активностью (по казенну) до 100 ПЕ/мл,высокой термостабильностью в присутствии субстрата, способных гидролизовать субстрат в широком дипазонерН, проявляя при этом высокую активность. Неспецифическое комплексообразование между полиэтиленоксидом,и протосубтилином в водном раствореспособствует иммобилизации в результате сближения реагирующих молекулв момент радиохимического взаимодействия.П р и м е р 1. 5 г протосубтилинарастворяют в 95 мл 0,05 М боратногобуфера рН 8,4 при 2-4 С в течение30 мин. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием при 7100 яв течение 30 мин. К 8 мл супернатанта 45добавляют 42,5 мл 10,0 .-ного водногораствора полиэтиленоксида 1500. Соот"ношение (весовое) протосубтилин;полиэтиленоксид 1:8,5. Смесь ферментас носителем облучают тормозным :-излучением в дозе 2,5 мрад.50При этом получается продукт соследующими свойствами.Протеолитическая активность93,0 ПЕ/мл,Термостабильность.е, Сй 37 45 50 60 70 80 Активность,.; 34 46 71 100 49 8 Зависимость активности от рН субстрата (1 . сывороточного альбумина):рН 6 фО 8 э 2 8.э 6 11 юОАктивность,: 47 66 68 100Продукт растворим. Выход 98,011,0 ,П р и м е р 2Готовят растворпротосубтилина по методике, описанной в примере 1. К 8 мл раствора протосубтилина (супернатанта) добавляют37,5 мл 10,0 -ного раствора полиэтиленоксида 1500. Массовое соотношениепротосубтилин:полиэтиленоксид 1:7,5.Смесь облучают тормозным-излучением в дозе 2,5 мрад.Свойства получаемого продукта.Протолитическая активность105,0 ПЕ/мл,Термостабильность.с,С 37 45 50 60 70 80Активность, У.ф 34 46 71 100 49 8Зависимость активности от рН субстрата (1 сывороточного альбумина);рН: 6,0 .8,2 8,6 11,0Активность,.: 47 66 78 100Продукт растворим. Выход 98,0.1 +1,0 .П р и м е р 3. Готовят раствор протосубтилина по методике, описанной в примере 1. К 8 мл раствора протосубтилина (супернатанта) добавляют 40,0 мл 10,0 -ного раствора полиэтиленоксида 1500. Смесь облучают тормозным-излучением в дозе 2,3 мрад.Свойства получаемого продукта.Протеолитическая активность 120,0 ПЕ/мл.Термостабильность., С; 37 45 50 60 О 80Активность, : 40 49 70 100 48 8Зависимость активности от рН субстрата (1 сывороточного альбумина):рН: 6,0 8,2 8,6 11,0Активность,: 50 65 71 100%,Продукт водорастворим, Выход 98,01й 1,0 ,П р и м е р 4, Готовят растворпротосубтилина по методике, описан-,ной в примере 1. К 8 мл растворапротосубтилина (супернатанта) добавЗависимость активности от рН субстрата (1 сывороточного альбумина):рН 6,0 8,2 8,6 11,0 Активностью .: 53 69 70 100 й, С: 37 45 50 60 70 80 Формула изобретения Активность, : 38 51 70 100 45 11 Зависимость активности от рН субстрата (1 сывороточного альбумина):рН 60 82 8,6 11,0 Активность, : 51 70 78 100 40 Продукт водорастворим, Выход98,04.1,0 ,Составитель ВЛуронец Редактор. Н,Гунько . Техред М.Дидык Корректор М.ВасильеваЗаказ 6355/23 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ляют 40,0 мл 10,0 -ного раствора полиэтиленоксида 1500. Смесь облучают тормозным-излучением в дозе 2,7 мрад.Свойства полученного продукта.Протеолитическая активность 80 ПЕ/мл.Термостабильность,Е, С: 37 45 50 60 70 80 10 Зависимость активности от рН субстрата (1 сывороточного альбумина).рН 6,0 8,2 8,6 11,0 15 Продукт водорастворим, Выход 98,0 ф +1,0 .П р и м е р 5. Готовят раствор про"20 тосубтилина по методике, описанной в примере 1. К 8 мл раствора протосубтилина (супернатанта) добавляют 40,0 мл 10,0 -ного раствора полиэтилеиоксида 600. Смесь облучают тормозным -излучением в дозе 2,5 мрад.Свойства получаемого продукта.Протеолитическая активность 85,0 ПЕ/мл.30Термостабильность. П р и м е р 6. Готовят растворпротосубтилина Г 10 Х по методике,описанной в примере 1. К 8 мл раство 48 4ра протосубтилина (супернатанта) добавляют 40,0 мл 10,0 -ного раствора полиэтиленоксида 2000. Смесь облучают тормозным-излучением в дозе 2,5 мрад.Свойства полученного продукта.Протеолитическая активность 110,0 ПЕ/мл.ТермостабильностьАктивность,Х; 56 80 81 100 Продукт водорастворим. Выход 98,0 й +1,0 ,Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получать иммобилизованный протосубтнлин с улучшенными качественными характеристиками, а именно с высокой протеоло" гической активностью, с повышенной термостабильностью в присутствии субстрата и с расширенным рН-оптимумом активности. Способ получения иммобилизованного протосубтилина, включающий взаимодействие раствора ферментного препарата .с органическим носителем, о г. - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения качества целецого продукта, в качестве носителя используют полиэтиленоксид с мол.массой 6002000 И, устанавливают соотношение носитель-Фермент 1:7,5 - 1:8,5 с последующим облучением смеси-лучами дозой 2,3-2,7 мрад.э