Способ получения экстракта, обладающего иммуномодулирующим действием, из животного сырья

(51) 4 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ИЗОБРЕТЕН ПИС Н ПАТЕНТ пр ен- авюл. Ф 44 ль АГ (8 ли (82) 5 (088,8 Лог 1 Аса У 249, р й4. у4(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКЛАДАКЗЦЕГО ИММУНОМОДУЛИРУЮЦИМВИЕМ, ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ(56) Аппа 1 з НемЯс 1 епсез, 1975,не, точнее к способам полученйя лекарственных средств. Цель изобретения - упрощение технологического оцесса. Для этого порцию тимуса телка измельчают до кашицы, к ней добляют апирогенную бидистиллированнуюводу и в проточном нагревателе осаждают высокомолекулярные составныечасти 10 мин при 80 С, Затем кашицуохлаждают и центрифугируют. К надосадку добавляют для непрерывнойультрафильтрации апирогенную воду.Ультрафильтрат подвергают электродиализу 2 ч при 30 С, напряжении12 В, максимальной силе тока 40 А.Выход экстракта составляет 1,6-1,54Изобретение относится к медицине,а именно к способам получения лекарственных средств,Цель - упрощение технологическогопроцесса.П р и м е р 1, 5 кг тимуса теленка, освобожденного от жировых тканейи хранящегося при температуре - 25 С,измельчали в мясорубке до кашицы. Ккашице добавили 5 л апирогенной, би"дистиллированной воды и в проточномнагревателе осаждали высокомолекулярные составные части в течение10 мин при 80 С. После этого кашицуохлаждают и центрифугируют, К надосадку добавляют для непрерывнойультрафильтрации еще 10 л апирогенной воды (поверхность мембраны 2,5 м,гРМсистема Ромикон НР 1/ЗБ). Ультрафильтрат, выпаренный до объема 1 л,подвергают электродиализу при полнойповерхности мембраны 444 см в тече 2ние 2 ч при постоянной температуреЗО С, напряжении 12 В, максимальнойсиле тока 40 А, Выход экстракта равен .58 г (1, 163)П р и м е р 2, 250 кг свежих селезенок здоровых телят (жировая тканьудалена). Замороженные куски гомогенизировали в волчке для мяса. Полученную кашицу нагревали с 250 л апирогенной воды в непрерывном нагревателе (длина трубки 20 м) в течение 5 мин до 80 С, затем охлаждали в непрерывном охладителе в теочение 6 мин до 4 С. Центрифугировали, Надосадок подвергли ультрафильтрации непрерывно при добавлении 900 лапирогенной воды (м.в, (10 000 дальтон). Ультрафильтрат испарили в циркуляционном испарителе и после это"го стерилизовали. Концентрат селезенки порциями по 5 л подвергалиэлектродиализу при поверхности мембраны 1776 см, постоянной темпера 45отуре 37 С, постоянном напряжении50 В, максимальной силе тока 45 А втечение 3 ч. Проведение способа осуществили в закрытой системе. Выход3850 г (1,547).50П р и м е р 3. Эпителиальные клетки эмбриональных точек теленка (УКАЗЕ)культивируют в подвижных бутылях до850 мл с "минимальной эссенциальнойсредой" и 77 эмбриональной сыворотки теленка, Незадолго до образованиязакрытого клеточного покрова, последний промывают раствором поваренной соли (рН 7,2) и освобождают иэ подвижных бутылей с помощью этилендиаминтетраацетата воды, а также резинового скребка и помещают в 4 л бидистиллированной апирогенной воды,Клетки РКИЕ (4 10 (мл) растворяюти размельчают в 100 мл порций ультразвуком ( "Сонипреп" 150 : амплитудак4, средняя частота/ в течение 1 мин,Клеточную массу УКАЗЕ нагревают с 4 лводы в проточном нагревателе,до темопературы 80 С и через 10 мин охлаждают до температуры 10 С. Денатурированные белки и другие нерастворимыеклеточные вещества отделяют путемцентрифугирования в Богъа 11-центриФуге с проточным ротором Т 2 - 28(20000 об/мин, дпительность обработки 10 мин), Затем надосадочную жидкость непрерывно подвергают ультраФильтрации с 8 л бидистиллированнойи апирогенной воды (граница м.в. )710 000),Ультрафильтрат концентрируют до500 мл и подвергают электродиализу.Выход 55 мг на 100 мл культуры (О, 673) .П р и м е р 4. Сыворотка кровителенка,К 6 л сыворотки из свежей кровителенка подают 3 л свободной от пирогенов воды, Эту суспензию нагревают в проточном нагревателе до температуры 75 С, выдерживают в течение5 мин при одинаковой температуре изатем охлаждают в подобной системетрубы до 4 С, Осажденные веществаотделяют путем центрифугирования,Надосадочную жидкость объемом 5,5 лнепрерывно подвергают ультрафильтрации путем подачи 15 л свободной отпирогенов воды (м.в. 10 000 дальтон),После значительного удаления солей при помощиэлектродиализа получают стерильный и свободный отпирогенов раствор. Этот низкомолекулярный экстракт сыворотки способствует нормализации полиферации вфибробластах, обратимо поврежденныхв культуре.П р и м е р 5, Свежая кровь теленка,5 л свежей крови теленка перемешивают с 5 л свободной от пирогеновводы в проточном нагревателе до темопературы 80 С, Через 3 мин постоянной температуры суспензию охлаждаютов проточном охладителе до 4 С и удаляют осажденные продукты путем цент3 144рифугирования. Надосадочную жидкостьобъемом б л подвергают непрерывнойультрафильтрации .подачей 18 л свободной от пирогенов воды (м,в, 10 000дальтон), После значительного удаления солей путем электродиализа полу,чают стерильный, свободный от пирогенов раствор, Полученный, таким образом, низкомолекулярный экстракт изкрови теленка способствует нормализации пролиферации в фибробластах,обратимо поврежденных в культуре.П р и м е р 6. Дефибринированнаякровь теленка,5, 1 кг дефибрированной крови теленка нагревают с 5 л свободной отпирогенов воды в проточном нагреваотеле до температуры 80 С и выдерживают в течение 5 мин при одинакововысокой температуре, Затем кашицуохлаждают в проточном охладителе доотемпературы 4 С и удаляют осажденныевещества при помощи центрифугирования. Надосадочную жидкость объемом7 л непрерывно подвергают ультрафильтрации подачей 18 л свободной отпирогенов воды (м.в. ( 10 ОСО дальтон), После осуществления электродиалиэа получают обедненный солями,стерильный и свободный от пирогеновконцентрированный раствор, Растворспособствует нормализации полиферации в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре.П р и м е р 7. Спинной мозг теленка,предельной дезокситрасферазы в клет-ках костного мозга,П р и м е р 8, Мозг иэ бедренных5костей,Кашицу из 3,5 кг мозгов и из 30 кгбедренных костей свежеэаколотых телят нагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе10 до температуры 75 С. Полученную суспензию выдерживают в течение 5 мин.После охлаждения в проточном охладителе застывший жир отделяют от оставшегося раствора. После центрифугиро 15 вания обезжиренного раствора надоса"дочную жидкость объемом 5 л непрерывно подвергают ультрафильтрации подачей 15 л свободной от пирогенов воды(м,в,10 000 дальтон). Из концентрированного препарата путем электродиализа вьщеляют ионы соли. Обедненныйсолями раствор является стерильными свободным от пирогенов. Растворспособствует нормализации пролифера 25 ции в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре, и повышению активности предельной дезокситрансферазы.П р и м е р 9, Плацента овцы.4,700 кг кашицы из сильнозаморо 30 женных розеток свежей плаценты овцынагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе дотемпературы 80 С и выдерживают в течение 5 мин в процессе циркуляции,о35После охлаждения до температуры 4 Сотделяют вещества, выпавшие в осадок,путем центрифугирования и надосадочную жидкость объемом 7 л подвергаютультрафильтрации непрерывно при по 40 даче 10 л свободной от пирогенов воды (м.в. . 1 О 000 дальтон). Полученный путем злектродиализа обедненныйслоями раствор был стерильным и свободным от пирогенов. Раствор способ 45ствовал нормализации пролиферациив фибробластах, обратимо поврежденных в культуре.П р и м е р 10. Тимоциты.10 кг свежих органов эобной желе 50зы теленка растирают с 10 л раствораповаренной соли (рН 7,2) с фосфатными буферными свойствами в мелкоячеистом сите резиновой пробкой, Вследствие этого из тканей органов отделяюттимоциты, оставшиеся ча,.ти тканей55выбрасывают. Затем тимоциты дваждыпромывают раствором поваренной солис фосфатными буферными свойствами изатем помещают в 10 л бидистиллироИз костей позвонка свежеэаколотого здорового теленка изолируют 5 кг мозга и нагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагреователе до температуры 80 С и выдерживают в течение 5 мин в постоянной температуре. Затем кашицу охлаждают в проточном охладителе до температуры 4 С. После центрифугированияо1/3 объема, как надосадочную жид кость, используют непосредственно для следующей ступени. 3 л подвергают ультрафильтрации с 9 л свободной от пирогенов воды (м.в. с 10 000 дальтон), Иэ концентрата путем, электродиалиэа выделяют ионы соли. Обедненный солями раствор был стерильный и свободным от пирогенов. Он способствовал нормализации пролиферации в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре и повышению активностиФормула и з о б р е т е н и я Составитель Л,ПокрышкинаТехред А.Кравчук Корректор И.Максимишинец Редактор Ю.Середа Заказ 6297/58 Тираж 655 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1 1 3035 р 1 р 1 осква р Ж 35, Раушская наб д, 4/ 5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 514420ванной, свободной от пирогенов воды(18 10 ф клеток/мл) . Тимоциты растворяют и размельчают 100 мл порциями ультразвуком (Сонипреп 150 : Амплитуда 4, средняя частота) в течение 1 мин, Кашицу из тимоцитов нагревают с 10 л бидистиллированной свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе до температуры 80 С и через 10 мин снова охлаждают до температуры 10 С. Денатурированные белки и другие нерастворимые клеточные вещества отделяют путем центрифугирования в Богча 11-центрифуге с проточным ротором Т 2-28 (20 000 об/мин, длительность обработки 10 мин) . Затем надосадочную жидкость непрерывно подвергают ультрафильтрации еще с 20 л бидистиллированной, свободной от пирогенов воды (Граница растворения м.л. ) 10 000), Ультрафильтрат концентрируют до 2 000 мл и подвергают электродиализу. Продукт, содержащий пептиды, проявляет в СО поврежденных фибробластах активность, стимулирующую рост.П р и м е Р 11, Культура фибробластов.Человеческие кожные фибробласты (клеточная линия ССЕ) культивируют во вращающихся бутылочках объемом 850 мл со средой КРМ 1 и 107, внутриутробной телячьей сыворотки. От связанного слоя клеток отделяют среду и клеточный слой обмывают два раза раствором поваренной соли, имеющей кислотность рН 7,2,Клетки отделяют с помощью резинового шибера со стен бутылок и поме 40 щают в 0,5 мл воды на квадратный сантиметр, всего в 4 л воды. Порциями в 64 6100 мл еще интактные клетки закрывают и размельчают в течение 1,5 мин с помощью ультразвука (Сонипреп, амплитуда 4, средняя частота).Кашицу из клеток быстро нагревают в следующих 4 л воды до 90 С и спустя 3 мин снова охлаждают до 4 С, Денатурированные протеины и фрагменты клеток отделяют с помощью Богча 11- центрифуги с ротором ТЦ(20000 об/мин, время 10 мин), Ультрафильтрованную выстоявшуюся жидкость (предельная величина м.в.10000) сгущают до 500 мл. Часть солей удаляют с помощью электродиализа. Содержащий малое количество солей клеточный экстракт оказывается не пирогенетическим и вызывает при обратимых поврежденных фибробластах быструю нормализацию пролиферации. 1Способ получения экстракта, обладающего иммуномодулирующим действием, из животного сырья путем гомогенизации сырья, нагревания гомогената и его охлаждения, осаждения надосадка с последующим удалением балластных белков ультрафильтрациейи отделением солей, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, удаляют белки смолекулярной массой выше 10000 дальтон, а отделение солей проводят электродиализом при 30-40 С,2, Способ по п,1, о т л и ч а -ю щ и й с я тем, что в качестве сырья используют клеточные культуры,гомогенизацию которых проводят,.ультразвуком.