Способ получения листериозного антигена

(51) 5 А 61 К 39/02 СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ ОПИ ИЗОБРЕТЕБИ(22) 22,04.86 (71) Всесоюзный нау но-исский институт ветеринарно гни и микробиологии (72) И,А.Бакулов, В,М.КотВ.Е.Белоусов. Д.А.ВасильеЛ.В.Макеева и А.А.Цыганов (53) 616.078 (088.8) (56) Ветеринарные нрепарред.Д,Ф.Осидзе, М., 1981,ледовате ирусолоро ты. Под с,254-2 ИЯ ЛИСТЕРИОЗНОГО осится к аетеримикробиологии, нию диагности елью изобретения пецифичности нАнтиген получают териальной сус(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН АИТИГЕНА(57) Изобретение отн нарной и медицинской в частности к получе ческих препаратов. Ц является повьппение с активности антигена, после разрушения бак пензии методом баллистической дезинтеграции. Длительность дезинтеграции2-2,5 ч. Частота колебаний стакановдезинтегратора 3600 + 200 в 1 мин.Способ дезинтеграции позволяет использовать в антигенном препарате какповерхностные, так и внутриклеточныеантигенные детерминанты. Центрифугируют дезинтеграт в режиме 10000+100в течение 20-30 мин. Лиофилизацияантигена удлиняет срок его использования. Стандартизация по белку в пределах 3-3,3 мг/мп, остаточной вла.=ности и данным ИК-спектроскопии повышает его качество, Полученный антигенпо сравнению с коммерческим антигеномУНИИЭВ обладает более высокой активностью и специфичяостью. Он выявляетвсе лнстериозные сыворотки. Не реаги-.рует с нормальными и гетерологичньеисыворотками. 2. табл.Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии и может быть использовано для получения бактериальных диагностических препаратов.Целью изобретения является поныше" ние специфичности и активности анти- гена.П р и м е р 1. Для изготовления антигена используют штаммы Ивйегха шопосуйояепеа 1-го(штамм 766) и 2-го (штамм 634) сероваров,Расплодки бульонных культур листерий штаммов 1 и 2 сероваров (возраст 18-20 ч)засевают иа агар Д или ИПЛ с 0,5-1 Е глюкозы, разлитый в матроные колбы, Культиэнруют при 37 С нь течение 18-24 ч. Работу ведут параллельно с каждым штаммом в отдельности 20 до стадии смешивания продукта, после стандартизации. Культуры листерий смывают с поверхности ИПА физиологическим раствором хларида натрия рН 7,2-7,4, Трижды отмывают от отстатков 25 питательной среды путем центрнфугирования при 2000 , ьн течение 25 мин. Супернатант удаляют, Полученный осадок ресуспендируют в физиологическом растворе хлорида натрия (рН 7,2-7, Ц, 30 и, в сравнении с оптическим стандартом мутности, устанавливают концентрацию микробных тел в одном миллнлчт" реот 5 х 10 до 15 х 10Суспензию биомассы листерий в стерильньп условиях разливают н стаканы35 дезинтегратора, куда добавляют стеклянные бусы (диаметр бус 0,12 мм), и подвергают баллистической дезинтеграциио1 РфУсловия и режимы дезинтеграции:. объем микробной суспензии в стакане25 мл; масса стеклянных бус 40 г (соответствует объему 25 мл); частота колебаний стаканов дезинтегратора 3600 в 1 мин; продолжительность дезинтеграции 120-150 мин. Разрушенную бактериальную суспензию (дезинтеграт) ноднерх ают центри"фугированию при 10000 а в те тение25 мин. Суспернатант отделяют пипеткой в стерильный флакон и инактнвируют мертиолятом в конечной концентрации 1 з 20000, Полученный ангиген,состоящий и основном из фракции ци-топлаэмы и мелких осколков клеточнойстенки листерий, проверяют на стерильность.,Стаипартиируют по содержанию белка (3,0-3,3 мг/мл) и ИК-спектроскопии (в диапазоне 780-1500 см ). Затеи образцы антигена, полученные из серонаров 1 и 2 р смешинают н равных пропорциях и разливают и стерильные ампулы по 1 мл. Намораживают в течениеь 48 ч при температуре минус 40 С, после чего проводят его сублимационную сушку. В сухом антигене определяют остаточную влажность, которая не должна превышать 37.Цитоплаэменный листериозный антиген для РСК представляет собой белый порошок с желтоватым оттенком, хорошо растворяияцийся в физиологическом растворе.П р и и е р 2. Для оценки специфической активности полученного анти- гена используют положительные и отрицательные (нормальные) сыворотки крови кроликов, овец и крупного рога" того скота.Дополнительные компоненты реакции: 2.,5 Е навесь эритроцитов барана, коммерческий комплемент сухой для реакции связывания комплемента и гемолизин, физиологический раствор хлористого натрия рН 7 2.Реакцию связывания комплемента (РСК) с испытуемым антигеном н сравнении с коммерческим антигеном УНИИЭВ ставят согласно наставлению по лабораторной диагностике листериоза животных.Перед комиссионным опытом участнующие н реакции пробы положительных и отрицательных сывороток зашифронывают, Результаты испытаний представлены н табл 1 и 2.Как,видно из табл, 1 н 2, предлагаемый антигеи нсравнении с .коммерческим обладает .более высокой активностью и специфичностью: ныянляет все листериозные сыворотки и не реагирует с нормальными и гетерологическими сыворотками,.Таким образом, способ изготовления пнстсриознога антигена для РСК обеспечивает (по сраннению с известным способом) получение высокоактивного и высокоспецнфическога диагностнкума, что позволяет резко повысить достоверность результата РСК при листерио-, зе. Разработанный режим лиофнлизапии полученного диэентеграта позволяет выпускать препарат н сухом нице, что увеличивает сро".с его использованияТаблица Результаты комисслонньгх спытаний активностии чувствительности листериоэного антигена дляРСК и коммерческого антигена УНГЛЗВ с заведомо положительными листериоэными сыворотками Кол-во проблистериоэныхсывороток Время уче-Резуль-аты РСК та реакцииположи-аомнитель" отрицатель тельныйныйный Антигеи 44 Предлагаемый еэ 16 44 КоммерческиУНИИ ЭВ Через 18 ч РеэультаГы комиссионных исжтности листериозного атигенамерческого антигена УНГЗВ сцательными и гетерологичными Кол-вопроб норезультаты РСК Антиг ремл учеа реакции л П ло.; - : -проб гетерологичных Сяк:ительньщ адат-льных сывороток ыворок 164 Предлагаемый 166 азъг 0 Чере з 16 Сразу 3 14415до 3 лет (срок наблюдения). Применяемые критерии стандартизации препарата,включающие показатели белка, остаточной влажности ИК-спектроскопии позЭ р Йволяют контролировать выпуск стандартного антигена, что повышает его ка"чество,Формула изобретения10Способ получения листериоэного ацтигеиа, включающий раздельное культивирование щтаммов Ьдвегха щопосуояепев 1-го и 2-го сероваров, приготовление микробных суспензий, выделение ;я 1 иэ них я тигенных детерминант, очистку каждой жидкой Фракции в центробекном поле с получением супернатанта,с последуипим их смешивайием в соотношении 1 ф 1, отличающийс я тем, что, с целью повьппения спв"цифичнос"и и активности целевого продукта, выделение антигенных детерми".нант осуществляют путем баллистической дезинтеграции микробной суспензпи до раэру пения клеточных стенок,а очистку недуг при Факторе разделени; в . 10000 10100 Е в течение 2030;лин,7 а б л н ц а 2 анин специ;ричдля РСК и комзаведомо отри"сыворотками6Продолжение табл.2 Рез льтаты РСК Антиген Время уче та реакци 4 ФХВй Е 4 аееЮФ 4 еПоложи- Сомни- Отрицательтельный тельный ный 1 Сразу 13ТИРОЛЕ Подписное 1 ВНИИПИ Государстввнногю комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5