Способ определения активности тромбина

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН Я 011 78 А 4(51) С 01 М 33/48, А 61 В 1 О/00 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН концентрации 2-5 мг/м ляют интенсивность фл исследуемом растворе фибрина, а активность определяют по формуле далее опреде"есценции вле отделенияомбина (С ) У 22и Е.В.Барковскийчно-исследовареливания крови С,=К ) Зф 89 э р 378(54)(57) СПОСО НОСТИ ТРОМБИНА РЕДЕЛ КТИВйствия юоре кон утем взаимодпоследующимности по уроВ в опытной риногеном елением его актиринопепгидов Аролвной пробах,ню фиби контщ и йтличаелью повыш с я тем, что, с специфичности оп дуемую пробу доп фибриноген, обра миносульфанилхло еделени сследят олнительно в ботанный 5-д ридом в коне ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ( СВИДЕТЕЛ(71) Белорусский нтельский институт(56) В 1 осЬет. 1. 1 3 - интенсивность флценции опытной ирольной пробы;.И - степень усиления флюориметра;1( - коэфФициент, равныйотношению величиныинтенсивности флюорценции к активноститромбина в стандартпробе.1161878 3Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в диагностике нарушений системы свертывания крови.Цель изобретения - повышение специфичности анализа активности тром- бина.Сущность изобретения заключается в следующем.В качестве субстрата для определеО . ния активности тромбина применяется раствор дансилированного фибриногена. Дансилирование фибриногена. осуществляется по методу, сущность которого заключается в том, что 15 аминогруппы фибриногена реагируют с Флюоресцентным красителем дансилхлоридом в щелочной среде с образованием ковалентной связи. Под влиянием тромбина от молекул дансилированпого 2 О фибриногена отщепляются флюоресцентно-меченные ниэкомолекулярные фибринопептиды А и В. После осаждения белков из реакционной смеси 30%-ной трихлоруксусной кислотой количество Фибринопептидов в надосадке определяется флюориметрически, При определении количества тромбина в биологических жидкостях на результаты определения не отража- ЗО ется наличие в ниах других нивкомолекулярных пептидов ввиду отсутствия флюоресцентной метки у последних.Примеры конкретного применения способа,П у и м е р 1. Определение актив. ности, тромбина в модельной системе.По 2 мл 1%-ного раствора дансилированного фибриногена разливали в 4 О 4 пробирки. В каждую пробирку добавляли по 0,1 мл раствора тромбина в следующих соотношениях: 1:1; 1.:2;1:4; 1:8. Через 15 мин реакцию прерывали добавлением 2,0 мл 30%-ной ТХУ кис 45 лоты, Пробы центрифугировали 10 мин при 1300. Надосадочную жидкость Флюориметрировали на микрофлюориметре Рса. Длина волны возбуждения флюоресценции 365 нм; длина волны я регистрации флюоресценции 520 нм. В контроле к 2,0 мл фибриногенар добавляли 0,1 мл 0,9%-ного раствора ЯаС 1. Данные приведены в табл, 1. Результаты выражены в единицах отно- у сительной активности.Активность тромбина рассчитывают по формуле где ) и 3 - интенсивность флюоресценции опытной и контрольной проб;и - степень усиления прибора",- коэффициент пропорциональности, рассчитываемыйэкспериментально для конкретного типа Флюориметрапутем деления интенсивности флюоресценцииопытной пробы на количество единиц активноститромбина в пробе,П р и м е р 2. В 4-х пробах к0,5 мл исследуемой цитратной плазмыдобавляли 1,5 мл раствора дансилированного Фибриногена, содержащего 105-2-1 мг белка, Для рекальцификациивносили 9,1 мл 1,28%-ного растворахлористого кальция. Через 15 минреакцию прерывали добавлением 2,0 мл30%-ного раствора ТХУ кислоты, В конт=роле вместо раствора хлористого кальция добавляли О, 1 мл 0,9%-ного раствора НаС 1. Пробы центрифугировали10 мин при 1300, Надосадочнуюжидкость Флюориметрировали на микроФлюориметре Рхса, длййа волнывозбуждения 365 нм, длина волны регистрации флюоресценции 520 нм.Результаты выражали в единицах относи-:тельной Флюоресценции (табл. 2),Сравнение этих данных с результатами примера 1 показывает, чтоактивность тромбина в пробах плазмыбыла низкой, соответствуя большимразведениям тромбина (1:8 - 1:16),вызывая однако достаточную рабочуюинтенсивность флюоресценции фибричопептидов при установке чувствительности прибора на среднюю степень,3П р и м е р 3. С целью сравнениячувствительности определения белкаи его дериватов методами Лоури ипредлагаемым способом (флюориметрически) проведены следующие исследования. Приготовлены разведения дансилированного фибриногена, содержащиев пробе от 2800 до 0,14 мкг белка,Производили определение белка впробах по методу Лоури и флюориметрическина микрофлюориметре Рхса при длине волны возбуждения Флюоресценции 365 нм и длине волны регистрации 520 нм. Полученные данныепредставлены в табл. 3,П р и м е р 4. Тромбин-Фибрикогеновая реакция поставлена в следующей системе, К 2,0 мл 0,57-ного Враствора дансилированногс Фибриногена добавлено 2,0 мл 403"ного раст -вора мочевины и 0,2 мл растворатромбина с активностью 10 с. Пробуинкубировалипри 37 С 90 мин, Послеинкубации в пробу для осажденияФибриномокомеров и трсмбина добавляли 2,0 мл 87-кого раствора хлорнойкислоты. Пробу центрифугирсвали15 мин. при 8000 обм/мин. Надссадочкую 15жидкость, содержащую ФибрикспептидыА и В, отсасывали и ксррекгировалиее до 7.,5 с добавлением О, 12 мл103-ного раствора КОН. Соленой осадок удаляли повторным центрифугиро- щванием в том же режиме. Готовилиразведения Фибринопептидов А и В нафизиологическом растворе в 3, 12 и120 раэ, анализ проб осуществляли методом Лоури, как в прототипе, и йЯФлюориметрически, как в предлагаемом способе,Выход Фибринопептидов А и Б составил порядка 1:60 от веса взятогоФибринсгена, что совпадает с иэвест- уными данными теоретического анализа.Таким образом, полученкые данныепоказали, что для успешного применения метода Лоури для клиническогоопределения Фибринопептидов А и Вкак специфических показателей активности тромбика в тромбин-Фибриногенной реакции их содержание впробе должно быть выше 10 мкг(табл. 2, 3), что совпадает с известными данными литературы.Флюориметрический анализ позволяетувеличить чувствктельность способа .на 102Столь значительноеповышение чувсгвительностк способа и приведенныеданные показывают, что содержаниедаксилированкого Фибриксгена в пробев зависимостк от активности тромбинаможет колебаться в значительных .Япределах (6-6 х 10 мкг), Однако оптимальные колебания содержания дансилирсвакнсгс Фибриногека в пробе, ориентированные с одной стороны на низкие значения тромбиновой активности,а с другой - на рациональное расходование реагекта (как показывают примеры 1 и 2) составляют 2-5 мг. Приэтом создается возможность анализаактивности тромбина по уровню отщепляемых им от фибриногена Фибринопептицов А и В не только в модельныхсистемах (как в прототипе), но ив биологических образцах (плазма,сыворотка).П р и м е р 5. С целью выявленияспецифичности метки А и В пептидовФибриногека различными Флюоресцентсными зондами в технике предлагаемогоспособа были применены препаратыФибриногена, меченного аналинонафталинсульфонатсм магния (АНС), флюорескамином (ФК) и диметиламиконафталиксульфонилхлоридом (ДНС), являющиесяодним иэ относительно широко применяемых Флюоресцентных зондов.Б параллельных исследованияхв модели применялись растворы троибина (г.Каунас) с пропорциональноснижающейся активностью (40, 20 и10 ед.). Данные флюоресцентногосвечения Фибринопептидов А и В в акалогичньк системах опытов (флюориметр "Хиттачи", Япония) представлены в табл, 4,П р и м е р 6. К 0,5 мл исследуемок цифтраткой плазмы добавляли1,5 мл 1 Е-кого раствора дансилиро"ванного Фибриногена.,Для рекальциФикации внесено О, 1 мл 1,283-ногораствора хлористого кальция. Через15 мкн реакцию прерывали,добавлением2,0 мл ЗОХ-кого раствора ТКУ кислоты,Б контроле вместо раствору хлористогокальция добавляли 0 1 мл 0 9 Х-ксгсраствора НаС 1. Пробы цектрифугировалк10 мин при 1300. Надосадочную жидкость Фаооркметркровалк на флюсркметре Раса, длккв волны возбуждения 365 нм, длина волны регистрации520 нм.Результаты выражены в единицахотносительной Флюсресцекцки; контроль -3 ед, проба - 18 ед.1161878 Т а б л и ц а 1 Зависимость флюоресценции фибринопептидов от количествадансилированного фибриногена в пробе Интенсивность флюоресценции 2,2 33 62 Таблица 2 Всего фибриногенав пробе, мг 2,5 3,5 Количество дансилилированного фибриногена в пробе, мг 10 Таблица 3 Сравнительные данные чувствительности метода Лоурии флюоресцентного анализа при определении белка 14 1,4 0,14 1400 140 2800 Содержание белка, мкг 20 200 2000 20000 Степень разведения Больше Больше 0,48 0,07 0шкалы шкалыФЭК ФЭК О Энстанкция по Лоури 26 3,2 3,2 1,4 200 120 Флюоресценция, усл.ед. Разведениятромбина 1: 1 20 ед 1: 2 10 ед. 1: 45 ед 1: 82,5 ед Контроль2,0 ед1161878 Т а б л и ц а 4Результаты определения активности тромбина по техникепредлагаемого способа с применением фибриногена, меченногоразличными флюоресцентными зондами (усл,ед). 3Активность растворов тромбина (ед.) Зонд 10 0 (Контроль 40 АНС 1,4 1,2 1,4 4,1 ФК 4,7 9,0 ДНС Составитель .В. КузьмичевРедактор М, Келемеш Техред Т,Маточка Коррек С, Шорректор,С. Шекмар Заказ 3965/47 Тираж 897 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, ЖРаушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г; Ужгород, ул, Проектная, 4 4,716,2 20 )