Способ определения активности холинэстеразы

(51)5 6 01 М 27/ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт бимии наук(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ Изобретение относится к способам определения активности ферментов, конкретно к электрохимическому способу определения активности холинэстеразы путем измерения тока, и может быть использовано в промышленности для обнаружения холинэстеразы в средах их выращивания, в мониторинге окружающей среды при установлении ингибиторов холинзстеразы, например токсических фосфорорганических соединений, а также для клинических исследований в диагностических целях.Известен способ определения холинэстеразной активности, включающий гидролиз субстрата производного и-гидроксибензоилхолина под действием холинэстеразы с образованием и-гидроксибензойной кислоты, реакцию последней с ферментом гидролазой и-гидроксибензойной кислоты в присутствии кофермента никотинамидадениндинуклео(57) Изобретение относится к способам определения активности холинэстеразы путем электролиза исследуемого вещества в присутствии субстрата, Повышение экспресс- ности и удешевление процесса достигаются при использовании графитового электрода, модифицированного низкомолекулярными редокс-соединениями, например тетрациано-п-хинодиметаном, а в качестве субстрата - бутирилтиохолинхлорида. Электролиз ведется в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 8,0. Активность холинэстеразы определяется по скорости увеличения анод- ного тока. В результате можно определить активность холинэстеразы в интервале концентраций 0,045-4,5 ед/мл. 1 з.п, ф-лы, 4 табл. тидфосфата в восстановленной форме (НАДФН). При этом НАДФН окисляется до ни коти намидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ), Об активности фермента холинэстеразы судят или по величине уменьшения экстинкции, или по степени. потребления кислорода при превращении НАДФН в НАДФ.Недостатком этого способа является применение дополнительного фермента и , других дорогостоящих реагентов, таких как НАДФН,Известен спектрофотометрический способ определения активности холинэстеразы, заключающийся в том, что проводят гидролиз субстрата бутирилтиохолина под действием холинэстеразы в присутствии голубого красителя - 2,6-дихлорфенолиндофенола. Бутирилтиохолин при гидролизе высвобождает тиохолин, который непосред 1728770ственно восстанавливает этот краситель, переводя его в бесцветную форму, Изменение поглощения при 600 нм, обусловленное исчезновением 2,6-дихлорфенолиндофенола, прямо пропорционально активности холинэстеразы.Недостатками способа являются необходимость применения оптически прозрачных проб, длительность способа из-за того, что приготовленные растворы не подлежат хранению, а применяемый реагент 2,б-дихлорфенолиндофенол является канцерогенным веществом,Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности холинэстеразы, включающий приготовление реакционной смеси, содержащей калийфосфатный буфер рН 7,5 и субстрат - ацетилхолин, помещение ее в злектрохимическую ячейку, снабженную рабочим электродом из платины, предварительно химически модифицированной с помощью холиноксидазы (К.Ф. 1,1.3,17), и электродом сравнения, в качестве которого используют насыщенный каломельный электрод, дальнейшее введение в ячейку холинэстеразы, проведение электролиза при потенциале 0,8 В, измерение тока и определение активности холинэстеразы по увеличению анодного тока, Относительное стандартное отклонение составляет +1,8%,Ферментный электрод готовят следующим образом. Платиновую сетку (1 х 2 см) анодируют 1 ч при потенциале 2,5 В отн, н.к.э. в 0,1 М серной кислоте, кипятят 5 ч с 3-аминопропилтриэтоксисиланом в толуоле и отмывают, На одну сторону обработанной Р 1 сетки наносят б мкл 20%-ного раствора альбумина, 8 мкл 4%-ной холиноксидазы в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,0, 4 мкл 4%- ного глутарового альдегида и выдерживают в открытом воздухе 12 ч, Стабильность ферментного электрода 2 мес.Недостатками способа являются использование драгоценной платины, дополнительного второго фермента холиноксидазы и белка - альбумина, а также длительность процесса из-за трудоемкой обработки платиновой сетки, Способ требует сложной аппаратуры и специальных реагентов: 3-аминопропилтриэтоксисилан и токсичный глутаровый альдегид.Целью изобретения является увеличе-. ние экспрессности определения и удешевление процесса.Способ реализуется с использованием графитового электрода, изготовленного из стержня спектрально чистого графита, К одному концу стержня длиной 3-6 мм при помощи серебряного эпоксидного клея приклеивают медную проволоку, другой конец шлифуют наждачной бумагой (250 мкм) и на нем адсорбируют модификаторЭлектрод впрессовывается в тефлоновый корпус, 5 В качестве низкомолекулярного редокс-соединения для модификации электрода используют, нап ример, тетрациано-и-хинодиметан (ТЦХМ).Сущность способа объясняется схемой 10 ферментативной реакции с образованием .тиохолинхло рида+ ХЗн,н,ин,н,-ы-н,а151 Н " -снсвюн+нз-снсн,-мсн,сГнОбразовавшийся тиохолинхлорид реаги рует с окисленной формой адсорбированногона графитовом электроде модификатОра, (Мох) с образованием восстановительной формы (Мвос), Последняя окисляется электрохимически при потенциалах редокс-пре" " ио+жзн -ищ+(н 3),Износ 2 еох35 При электрохимическом окислении модификатора генерируется анодный ток. Скоростьувеличения анодного тока пропорциональнаактивности холинэстеразы,П р и м е р 1, Определение зависимости40 скорости увеличения анодного тока б Й 31 отконцентрации холинэстеразы.Электрод (диаметром 5,9 мм) модифицируют путем нанесения на поверхность 40мкл раствора ТЦХМ в толуоле(б мг/мл). Рас 45 творитель упаривают в воздухе в течение 2ч. После модификации электрод погружаютв термостатированную при температуре25 С стеклянную ячейку с 20 мл 0,1 М калийфосфатного буферного раствора рН 7,0, с50 помощью полярографа "ОН 105" по 3-электродной схеме определяют остаточный ток,В качестве рабочего электрода используютмодифицированный вращающийся графитовый электрод, электродом сравнения слу 55 жит насыщенный каломельный электрод,вспомогательный - Р 1 пластина, В растворвводится 50 мкл раствора бутирилтиохолин- .хлорида, Уровень стационарного тока почтине изменяется. В ячейку вводится 10 мклраствора холинэстеразы (К.Ф. 3,1,1,8, Пермский НИИ вакцин и сыворотки). Наблюдаютувеличение анодного тока.Зависимость скорости увеличения токаот концентрации фермента приведена втабл.1,Потенциал Е=О;15 В отн, н.к,э., скоростьвращения электрода в = 325 об/мин,1=25 С, Концентрация бутирилтиохолинхлорида 50 мкМ,Аналогично проводят измерения при скорости вращения электрода а 1031 об/мин,Установлено, что результаты измерений неменяются, поэтому определения для всех концентраций фермента проводят приодинаковых скоростях.Как видно из табл.1, линейность зависимости б 1/с 1 от концентрации фермента наблюдается от 0 до 4,5 ед/мл, При большихконцентрациях прямая зависимости б 1/ссот концентрации холинэстеразы загибается. Коэффициент корреляции прямой0,9997, стандартное отклонение 0,021 мкА.Чувствительность метода начинается с концентрации фермента 0,045 ед/мл.П р и м е р 2. Определение зависимостискорости увеличения анодного тока от концентрации бутирилтиохолинхлорида. концентрации БТХХ (табл.2), Потенциал0,15 В отн. н.к.эв = 325 об/мин, 0,1 Мкалий-фосфатный буферный раствор рН8,0, 1=25 С. Концентрация холинэстеразы4,5 ед/мл.Как видно из табл.2, линейность зависимости б 1/01 от концентрации бутирилтиохолинхлорида наблюдается в интервале от 0до 100 мкм. При больших концентрацияхкалибровочная прямая загибается, Стандартное отклонение в линейном участкепрямой составляет 0,02 мкА, коэффициенткорреляции 0,9917П р и м е р 3, Электрод изготавливаетсякак в примере 1. Проводится калибровкаэлектрода по отношению к тиохолину приразных потенциалах электрода, Для этогоопределяется остаточный ток 0,1 М калийфосфатного буферного раствора и вводится50 мкл раствора тиохолина в том же буфере.В течение 30 с устанавливается новый стационарный уровень анодного тока,Зависимость остаточного тока 1 ост и тока электрода 1 от потенциала электрода приведены в табл.3,Концентрация тиохолина 100 мкМ, Другие условия как в примере 1.Как видно из табл.3, в интервале от 0,3до,1 В практически можно провести измерения, но оптимальныеусловия обеспечиваются при потенциале 0,15-0,05 В отн. н.к.э.,поскольку отношение между током электрода и остаточным током Я/й наибольшее при5 этих значениях потенциала. Ниже укаэанного предела (т.е, - 0,2 В) не наблюдается окисление тиолов, а при потенциале более 0,2 Взначительно вырастает остаточный ток,обусловленный побочными электрохимиче 10 скими превращениям на рабочем электроде,П р и м е р 4. Определение активностихолинэстеразы, Берут 2 мг/мл исследуемогофермента в буферном растворе, Электрод15 изготавливается как в примере 1. Затем в0,1 М калий-фосфатный буферный растворрН 8,0 в присутствии 0,2 мМ бутирилтиохолинхлорида вводят разные объемы растворахолинэстеразы и записывают кинетические20 кривые изменения тока,Для вычисления скорости ферментативной реакции устанавливают величину тока.при использовании стандартного растворатиохолина -0,4 мМ, которая равна 0,220 мкА,25 При введении в ячейку 10 мкл (20 мкг) исследуемого раствора холинэстеразы изменение тока составляет 0,224 мкА/мин. Тогдаскорость ферментативной реакции вычисляется следующим образом: 400 мкМ - 0,2230 мкА, х - 0,224 мкА/мин, х = 407,3 мкМ/мин(в 1 л) или 8,14 мкМ/мин в. ячейке 20 мл.Активность фермента вычисляется по формуле35А, ед/мл=К-ОНО,а Ьгде К - коэффициент, равный концентрациитиохолина, мкМ, которая способствует из 40 менению тока в ячейке 1 мкА;а - измеренное изменение тока,мкА/мин,Ь - степень разбавления исследуемогообразца.45 Например, при введении в ячейку 10мкл исследуемой холинэстеразы получают400 мкМ 1818 20,22 мкА50Ь=2000,а=0,224 мкА/мин,А, ед/мл=814,5,Поскольку исследуемый образец содер 55 жал 2 мг/мл белка, то удельная активностьА, Е /мг=814,5/2=407,3Аналогично вычислены и другие скорости ферментативной реакции и активности,Данные приведены в табл.4.1728770 Таблица 1 Таблица 2 Из табл.4 видно, что наблюдается строгая прямолинейность увеличения тока б 1/б от активности холинэстеразы. Вычисленные из любой точки активности препарата близки (среднее 404,2 Е/мг белка), Относительное стандартное отклонение 1,267 ь (в известном способе 1,8). Вычисленная удельная активность из построенного калибровочного графика (скорость реакции - количество холинэстераэы) составляет 410 Е/мг, т.е. практически совпадает.Преимуществом способа является упрощение и удешевление за счет исключения трудоемкой обработки рабочего электрода и применения второго фермента холиноксидазы, белка - альбумина и 3-аминопропилтриэтоксисилана. Уменьшается токсичность способа, так как исключается применение глутарового альдегида. Метод более экспрессивен - в 8 раз сокращается время приготовления электрода (для приготовления модифицированного графитового электрода требуется 2 ч, а для приготовления Р 1 электрода - 16 ч), Повышается точность определения в 1,4 раза (относительное отклонение в й редлагаемом способе йе превышает 1,26;, а в известном - 1.8;),Формула изобретения 1. Способ определения активности холинэстеразы, предусматривающий приго 5 товление реакционной смеси, содержащей0,1 М калий-фосфатный буферный раствор исубстрат, введение ее в электрохимическуюячейку, снабженную рабочим электродом инасыщенным каломельным электродом,10 введение в ячейку исследуемого вещества,проведение электролиза с последующимопределением искомой величины, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличенияэкспрессности определения и удешевления15 способа, в качестве субстрата использованбутирилтиохолинхлорид, в качестве рабочего электрода использован графитовыйэлектрод, химически модифицированныйнизкомолекулярными редокс-соединения 20 ми, электролиз проводят при потенциале0,15-0,05 В отн. н.к.э., а активность холинэстеразы определяют по скорости увеличения анодного.тока.2, Способ поп.1, отл и ча ю щи й с я25 тем, что в качестве низкомолекулярного редокс-соединения использован тетрацианоп-хинодиметан,1оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагари аказ 1404 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5